alamar blue测定细胞存活率增殖中文方法步骤.docVIP

Alamar Blue测细胞增殖及相关细胞毒性检测 实验原理 AlamarBlue是一种安全、稳定、易溶于水、且对细胞无毒的新型染料，可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。已被用于检测淋巴细胞、贴壁或不贴壁的人及动物细胞株、细菌及真菌的增殖;多种化学物质的细胞毒性试验;细胞凋亡的量化以及细胞介导的细胞毒性试验。避光储存于2-8℃，20个月。 活细胞能够将蓝色的氧化形式AlamarBlue变成红色的还原形式,同时发生可量化的荧光变化,无活性的细胞不能还原AlamarBlue。荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度。其颜色变化可用酶标仪测定，由于氧化和还原的吸收光谱可形成重叠,需测定570nm(还原)和620nm(氧化)两个波长处的OD值,OD570减去OD620得到的吸收值即反映了试验中细胞增殖的相对水平；其荧光变化可用荧光测定仪检测,激发波长530nm,散射波长590nm,使用荧光方法敏感性更好。 实验试剂 AlamarBlue； 3% SDS（配制：pH 7.4, 3% SDS 用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解） 实验材料 细胞。（适宜的培养基培养） 培养板（96-/384孔培养板） 实验步骤 药物处理完成后进行alamarBlue试验。 用培养基按比例稀释alamarBlue试剂，如下表所示： 培养板 细胞+培养基体积 10×alamarblue的体积 Cuvette 1mL 100uL 96-well plate 100uL 10uL 384-well plate 40uL 4uL 备注：96孔板中，将alamarblue和培养基1:9混合后直接加入细胞中，（90uL含药培养基+10uLAB）/well，或者先换成无血清培养基40uL+AB10uL，孵育6h以上，再加入培养基50uL，作用n小时后开始上机检测。细胞数2500-5000/well最好，54h终点。 2、37℃，5%CO2，培养1-4h，注意避光；待培养基的颜色由靛蓝青开始变成粉红色即可进入下一步。（也有说2-6h，且为增加灵敏度可延长至24h，HepG2孵育6h以上；培养时间因细胞不同有所差异，alamarblue法可以在多个时间点观察，实验人员可自行摸索） 3、测定荧光或吸光度，吸光度和荧光强度与活细胞数成正比。方法如下： （1）荧光测定：激发波长?540–570 nm (最大吸收570 nm)；发射波长580-610nm（最大吸收585nm）。检测用激发波长530nm，发射波长590nm，记录相对荧光单位（RFU）。 （2）吸光度测定：测定570nm和600nm的OD值，600nm作为参考波长。 4、绘制标准曲线或细胞生成曲线：纵坐标（Y轴）为相对荧光单位（RFU），横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度。 计算公式： 增值率（%）=【117216×A570-80586×A600（sample）】/【117216×A570-80586×A600（control）】×100% 药物抑制率（%）=【1-（Flu含药孔-Flu溶剂对照孔）】/【Flu细胞对照孔-Flu溶剂对照孔】×100% 5、可选步骤：在加有培养基和AB试剂的细胞中，加入50uL 30%SDS终止反应。 五、注意事项 1、检测灵敏度随着温育时间的延长而增加，细胞数量少的样品应延长孵育时间至24h。细胞浓度过高或孵育时间过长，会导致继发性还原反应，产生无色和荧光消失。温育时间要摸索。 2、荧光检测更为灵敏，无法检测荧光时测定吸光度。测试的培养板/管等应用锡箔纸包好，储存于4℃，1-3天内测定不会影响测定结果。