构建点突变质粒步骤.docxVIP

基因定点突变 一、 定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、 定点突变的原理 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定 就行了。 三、 引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： 通常引物长度为 25~45 bp,我们建议引物长度为 30~35 bp。一般都是以要突变的 碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了，很可能 会造成突变实验失败，因为引物至少要 11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变 PCR要求 两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少 12个bp,并且合成多一条反向互补的引物。 如果设定的引物长度为 30 bp,接下来需要计算引物的 Tm值，看是否达到78C (GC含量应大于 40%)。 如果Tm值低于78C，贝U适当改变引物的长度以使其 Tm值达到78C ( GC含量 应大于40%)。 设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 最好使用经过纯化的引物。 Tm 值计算公式:Tm=0.41 X(% of GC) ￡75/L+81.5 注：L:引物碱基数； % of GC:引物GC含量。 四、 引物设计实例 以G CG ACG为例： 5-CCTCC