RTPCR原理及实验步骤.docx

实用文档 RT-PCR 原理与实验步骤 一、知识背景： 1 、基因表达： DNA RNAProtein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 10 4 个丝心蛋白 mRNA （每个 mRNA 存活 4d，可以合成 10 5 个丝心蛋白） 共合成 10 9 个丝心蛋 白 。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2 、 PCR技术 (Polymerase chain reaction) ：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其 特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2 ＋存在下，退火引物沿 5’ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3 、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶（ reverse transcriptase ）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚 合酶，至少具有以下三种活性： 1 、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链； 2 、Rnase 水解活性：水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA； 3 、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA. 二、 RT-PCR 的准备： 引物的设计及其原则： 引物的特异性决定 PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚 型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : a、引物长度 :一般为 15 ～ 30bp ，引物太短会影响 PCR的特异性，引物太长 PCR 的最 适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出 现 3 个以上的单一碱基。 GC 含量（ Tm 值）： 40 ％～ 60 ％， PCR扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 5～ 10 度。 文案大全 实用文档 c、 3’端要求： 3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二 级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低， G、C 居中间，因此引物的 3’ 端最好选用 A、 G、 C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。 d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或 引物自身复性。 e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补， 3’端不应超过 2 个。 f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。 g、5’端无严格限制： 5’末端碱基可以游离，但最好是 G 或 C，使 PCR 产物的末端 结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0 ，Oligo6.0 等对于 这些条件都可以自行设置。 2、耗材： 实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、 EP 管之类事先都需经过 0.1%DEPC 水浸泡处理，除去 RNA 酶，防止操作过程中 RNA 降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。 、试剂准备： 变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、 75% 酒精、经 DEPC处理并高压的 水。 三、 RNA 的提取方法 RT－ PCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要，包括 RNA 的纯度和完整性。 RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活性非常稳定，分布广 泛，除细胞内源性 RNA 酶外，环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽 量创造一个无 RNA 酶的环境，包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（ DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶。 文案大全 实用文档 文案大全 实用文档 文案大全 实用文档 文案大全 实用文档 RNA 的琼脂糖凝胶电泳实验原理和步骤 来源：生物谷 访问量： 3688 评论 (0) 分享 1 一、实验目的 掌握植物总 RNA 非变性胶电泳的