应用酶学（完整课件）.ppt

第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?3、绿豆核酸酶（Mung Bean Nuclease）???? 绿豆核酸酶来源于绿豆芽，与 Sl 酶相似，但比 Sl 酶更温和。在大切口上才切割，更容易使双链DNA突出端变成平端。 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?4、核糖核酸酶 （Ribonuclease 或 RNase）???? 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。 1） RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性），为内切核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3‘ 端。可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区，可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA 。??? 核糖核酸酶 A 商品制剂可能会污染其它酶（如 DNA 酶），使用前应加热使 DNA 酶失活。 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?4、核糖核酸酶 （Ribonuclease 或 RNase）???? 2） 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?5、脱氧核糖核酸酶 Ⅰ （DNase Ⅰ） 1）特点： 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA ，产生5’-P低聚核苷酸。 Ca2+, Mg2+或Ca2+, Mn2+可使酶活达最大值 当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，独立作用于每条 DNA 链，且切割位点随机。两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，它可在两条链的大致同一位置切割 dsDNA ，产生平端或 1-2 个核苷酸突出的 DNA 片段。 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?5、脱氧核糖核酸酶 Ⅰ （DNase Ⅰ） 2）用途 a)标记切口平移时在 dsDNA 上随机产生切口，制备DNA探针 b)在闭环 DNA 上引入单切口，以将分子截短（在亚硫酸氧盐介导的诱变前）； c)建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序 d)在 DNA 酶足迹法（DNA footprinting）中分析蛋白:DNA 复合物； e) 除去 RNA 样品中的 DNA 。 Mn++存在时 Mg++存在时 DNaseI 作用特点 DNaseI HO P 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ DNaseI与 Pol I 的 切口移位 Pol I 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?6、外切核酸酶 Ⅲ（Exonulease Ⅲ，Exo III） ?1）一般特点 来自于E.coli，分子量28,000 kD 大肠杆菌外切核酸酶 Ⅲ 催化从 dsDNA 3‘-OH 逐一去除单核苷酸的反应，底物为 dsDNA 或线状和带切口或缺口的环状 DNA ，反应结果是在 dsDNA 上产生长长的单链区。 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?6、外切核酸酶 Ⅲ（Exonulease Ⅲ，Exo III） ?2） 催化反应类型 a) 外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 7.6-8.5 b) 核酸酶H（RNase H）活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5 c) 3’-磷酸酶活性（去磷酸） ：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 6.8-7.4 d) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH 7.6-8.5 第四节? 其它酶 五、核酸酶 （nuclease）?6、外切核酸酶 Ⅲ（Exonulease Ⅲ，Exo III） ?3）外切酶活性特点 a) 反应底物：互补ds-DNA b) 碱基释放速度：CA-TG c) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 但不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链 DNA 及带 3‘ 突出的 dsDNA 。 该酶持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的 DNA 。 第四节? 其它