实验一-鸡新城疫血凝(ha)和血凝抑制(hi)抗体水平测定法.pdf

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法 1．本次实验的目的和要求 掌握鸡新城疫血凝（HA ）和血凝抑制（HI ）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效 和制定合理免疫程序。 2．实验内容或原理 某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞 凝集现象(HA) 。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细 胞凝集抑制试验(HI) 。 3．需用的仪器或试剂等 动物 健康成鸡 2-5 只，被检鸡 15-25 只。 器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径 2mm 聚乙 烯塑料管 100cm、酒精灯、石蜡、96 孔 V 型微量凝集试验板、0.025mm 微量吸液器、微型 振荡器、微量移液器、脱脂棉等。 药剂（1）浓缩抗原；（2 ）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS ）；（3 ）Alsever 细胞保存 液；（4 ）红细胞悬液；（5 ）待检血清 4．实验步骤 (1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被 特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。 (2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如 抗体效价有 4 倍以上升高，即有诊断意义。 （3 ）免疫机体抗体效价的测定： 3.鸡新城疫（ND ）的HA 和 HI （1）试验准备 ① 抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或 LaUra 系冻干苗作为已知抗原，进行试验。 ② 0.7 ％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加 入 3.8 ％灭菌柠檬酸钠0.2 毫升做抗凝剂) 内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细 胞保存液内(保存液 2 份，血液 1 份)于 4℃冰箱内可保存两周。 红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经 3000 转／分钟，离心 5-10 分钟，用吸管 吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离 心机 3000 转／分钟离心 5-10 分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后 一次离心后的红细胞泥，按 0.7 ％的稀释度加入稀释液(0.7 毫升红细胞泥加 99.3 毫升稀释 液) 。 ③ 被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内(微 量法可用孔径 2-3 毫米塑料管由翅静脉采血) ，在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。 ④ 稀释液：为灭菌的生理盐水。 ⑤ 红细胞保存液的配制方法：葡萄糖 2.05 克，柠檬酸钠(SHOO)0.80 克，柠檬酸(2H 0)0.055 2 克，氯化钠 0.42 克，蒸馏水加至 100 毫升。过滤分装，高压灭菌 10 分钟，放 4℃冰箱保存。 (2)红细胞凝集试验(HA) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所 用病毒稀释倍数(抗原单位) 。 鸡新城疫病毒的 HA 试验与 HI 试验现采用微量法，以 u 或 v 形微孔塑料板代替试管。 ① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0.05 毫升) 。 ② 用微量移液器取病毒抗原 0.05 毫升，加入第一孔，反复抽动 6 次后，吸出 0.05 毫升加入 第二孔，在第二孔反复抽动 6 次后，吸出 0.05 毫升加入第三孔，如此连续稀释至第十一孔 后吸出 0.05 毫升弃去。第 12 孔不加病毒液为红细胞空白对照。 判断：沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔 底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。 如上例：病毒液的 HA 效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。HI 试验时，病毒 抗原液为 0.05 毫升内须含 4 个凝集单位，则应将原病毒液作成 64 ／4=16 倍的稀释液。 孔号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 滴度： 1 :2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:517 1:1024 1:2048 对照 稀释液