14 【终版】qRT-PCR方法检测特定基因的表达.pdf

实时荧光定量PCR方法检测 小鼠脾细胞特定基因的表达 qRT-PCR法检测特定基因的表达 1 实验背景 实时荧光定量PCR的优点是什么？ quantitative real-time PCR, qRT-PCR  通过荧光染料标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，从而实现实时、定量地对产物进行分析  比较多组细胞或者组织中基因表达差异的分析方法 1 实验背景 分析原代培养的脾细胞中哪个基因的表达？ 白细胞介素2 （interleukin-2, IL-2）  IL-2是由活化的CD4+辅助性T细胞产生的、具有广泛生 物活性的细胞因子，其在免疫调节中具有重要意义  脾是机体的免疫器官，位于左上腹部，含有大量的淋巴 细胞（包括T细胞、B细胞）和巨噬细胞 1 实验背景 Ionomycin：离子霉素 Ionomycin+PMA IL-2 mRNA的表达 PMA：佛波肉豆蔻醋酸 调控通路是什么？ 2+ CaM：钙调素 Ca /CaM block calcineurin：钙调神经磷酸酶 细胞质 calcineurin CsA CsA：环孢菌素A (activated) NFAT NFAT：活化的T细胞核内因子 (dephosphorylated) NFAT 细胞核 gene transcription IL-2 mRNA (produced) 1 实验背景 本实验以经典免疫抑制剂环孢菌素A （CsA）处理的 小鼠脾细胞为材料提取RNA并反转录 ，以所得cDNA 为模板运用实时荧光定量PCR显示和分析不同处理组 间IL-2表达量的差异。 2 实验设计 无菌操作 2 实验设计 细胞总cDNA的获取  利用oligo(dT) Primers反转录出cDNA 5′ 3′ AAAAAAA 反转录(reverse transcription, RT) AAAAAA TTTTTT DNA聚合酶 cDNA双链 2 实验设计  配制RT反应液反转录出cDNA ，反应如下： 试剂 使用量 终浓度 2+ 5× Buffer (dNTP, Mg ) 2.0