Ames试验的继承毒理学研究.docx

Ames 试验的继承毒理学研究 降纤酶（ defibrase ）已在临床广泛应用，如去纤、抗凝、调脂、扩张血管和改善微循环等，但作为异源蛋白，其在使用中不可幸免地具有蛋白质类药物的共同缺点，如具免疫原性、半衰期短、稳定性差等。聚乙二醇修饰技术是近年来进展的用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术，它将单甲氧基聚乙二醇分子键合到蛋白质分子表面，改变蛋白质的空间结构，进而改变其生化性质。此法可有效降低蛋白质的免疫原性，延长半衰期，减少给药次数。本实验的受试物是一种供注射用的含有聚乙二醇修饰降纤酶的药物组合物。为评价其是否具 有遗传毒性，本研究应用鼠伤寒沙门菌回复突变试验（亦称 Ames试 验）、体外培养中国仓鼠卵巢（ CHO）细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓 微核试验方法实行了检测，目的是为聚乙二醇修饰降纤酶的临床前毒 性评价提供资料。实验材料与动物受试物：聚乙二醇修饰降纤酶（纯 度： 98．9％，含量： 200UmL－1，批号：，由上海医药工 业研究院生物制药部提供，无色澄明液体。菌株：组氨酸缺陷型鼠伤 寒沙门菌（ S．typhimurium ）TA97、TA98、TA100、TA102和 TA1535菌株，由复旦大学公共卫生学院环境卫生学教研室赠予，贮存于液氮中。实验前实行菌株鉴定（ R因子鉴定、自发回变数鉴定），均符合规定标 准。 S9 代谢活化系统是从经过酶诱导剂处理的啮齿类动物的肝脏所提 取的带有辅助因子和微粒体部分，购于美国 MOLTOX公司。 CHO细胞由 复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予。 ICR 小鼠（ SPF 级）共 50 只，每组 10 只，雌雄各半， 7～8wk龄，体重 19～21g，由上海西普尔－必 凯实验动物有限公司提供，实验动物质量合格证号： 0047004。 实验方法与分组按《药物遗传毒性研究技术指导原则》及《 ICH 药品注册的国际技术要求（安全性部分）》的相关要求，应用 Ames 试验体外培养 CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓微核试验 8 检测聚乙二  6、 醇修饰降纤酶的遗传毒性，分别从 DNA损伤、基因突变和染色体畸变 3 个方面实行遗传毒性评价。 Ames试验：采纳标准平板掺入法，使细菌在加或不加代谢活化系统 （± S9）条件下接触受试物， 5 个菌株（ TA97、TA98、TA100、TA102 及 TA1535）均设 100、20、4、0．8、0．16U5个剂量组，每培养皿均加入相对应浓度的受试物溶液 0．1mL，此外设空白对比、溶剂对比和 阳性对比，每个剂量组及对比组均设 3 个平行皿。＋ S9 阳性对比：TA97、TA98及 TA100为 2－氨基芴（每皿 10μg）， TA102为 1，8－二羟基蒽醌（每皿 50μg）， TA1535为环磷酰胺（每皿 50μg）；－ S9 阳性对比： TA97 和 TA98为对二甲基氨基苯重氮磺酸钠（每皿 50μg）， TA100和 TA102为甲基磺酸甲酯（每皿 1μg）， TA1535为 4－硝基喹啉－ N－氧化物（每皿 0．5μg）；溶剂： 0．85％NaCl 溶液。 体外培养 CHO细胞染色体畸变试验：使细胞在加或不加代谢活化系统 （± S9）条件下接触受试物，高剂量组为托付单位提供的受试物原液 能够达到的最高浓度 10UmL－1，再分别以 5．0、2．5UmL－1 作为中、低剂量，共设 3 个剂量组；试验时在 10mL的试验体系中分别加入各浓度应用液 500μL，另设阳性对比和溶剂对比。＋ S9 阳性对比：环磷酰胺 60mgL－1，－ S9 阳性对比：丝裂霉素 C0． 5mgL－1，溶剂： 0．85％ NaCl 溶液。 小鼠骨髓微核试验：采纳小鼠尾静脉注射给药，剂量分别为 425、850、1700Ukg－1（分别约相当于 1／8、1／4、1／ 2 的小鼠经静脉 LD50剂量），给药容积为 10mLkg－1 体重；同时设溶剂对比组和阳性对比。 溶剂对比组给药方式与受试物组相同，以尾静脉注射给予溶剂（ 0．85％ NaCl 溶液）；阳性对比组以 40mgkg－1 体重的剂量腹腔注射一次给予环磷酰胺，给药容量均为 10mLkg－1 体重。 统计学方法 Ames试验结果的评价是以比较受试物各剂量组与溶剂对比组的回复突变菌落数为基础，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对比组回复突变菌落数的 2 倍以上，表现可重复性，并在一定的剂量范围内存有着剂量－反应关系，则推断为阳性。染色体畸变试验的畸变率和小鼠骨髓微核试验的微核率均采纳 χ2 检验与溶剂对比组实行比较，检验标准以 P＜0．05 为差异有统计学意义。 结果 1Ames试验受试物各剂量组和对比组的平皿均未见污染，并且可见背景菌生长。 5 个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性