流式细胞仪的原理和应用.pptVIP

流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析 流式细胞术（flow cytometery, FCM）是20世纪70年代发展起来的一种对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。 流式细胞术发展史 1930年 Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数； 1934年Moldaven是世界上最早设想使细胞计数自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细血管的细胞； 1936年Caspersson等引入显微光度术； 1940年Coons提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白； 1947年Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器； 1949年Wallace Coulter提出在悬液中计数粒子的方法的专利； 1950年Caspersson用显微分光光度计的方法在UV和可见光光谱区检测细胞； 1953年Crosslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器。同年，Parker和Horst描述一种全血细胞计数器的装置，称为流式细胞仪的雏形； 1954年Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器； 1959年B型Coulter计数器诞生； 1965年Kamemtsky等提出两种设想，一是用分光光度计定量细胞，二是结合测量值对细胞分类； 1967年Kamemtsky和Melamed在Moldaven的基础上提出细胞分选的方法； 1969年Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos, NM(即现在的National Flow Cytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计； 1972年Henzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号； 1975年 Kohler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。 流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞仪的特点 单个细胞或微粒分析 同时多参数分析 速度快：10000个细胞(微粒)/秒 统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 分选感兴趣的细胞或微粒 临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度 基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞(DC)研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究(MDR)、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究 FCM 的构造 FCM主要由以下五部分构成: ①流动室及液流驱动系统 ②激光光源及光束形成系统 ③光学系统 ④信号检测系统 ⑤数据与存储、显示、分析系统 （一）流动室与液流驱动系统 流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。 流动室内充满了鞘液，鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的，使样品流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 (二)激光光源与光束形成系统 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交，且相交于激光能量分布峰值处。 (三) 光学系统 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光），