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实验专题模块三 血液生化检验 ? 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 ? 血清尿素氮的测定 ? 血液是在心脏和血管腔内循环流动的一种组织。成人的血液 约占体重的十三分之一，相对密度为 1.050 ～ 1.060 ， pH 值为 7.3 ～ 7.4 ，渗透压为 313 mmol/L 。 ? 血液由血浆和血细胞组成。血浆内含血浆蛋白（白蛋白、球 蛋白、纤维蛋白原）、脂蛋白等各种营养成分以及无机盐、氧、 激素、酶、抗体和细胞代谢产物等。 ? 利用生物化学的方法，检测存在于血液中的各种离子、糖类、 脂类、蛋白质以及各种酶、激素和机体的多种代谢产物的含量， 叫做血生化检查。 ? 在正常生理情况下，其各种化学成分的含量非常恒定。但是， 机体的生理变化和病理情况，可导致血液的某些化学成分的含 量发生较大的变化。所以分析血液的化学成分可以了解人体物 质代谢的状况，并协助诊断或者判断预后。 ? 本专题将介绍血清蛋白与血尿素氮等两种生化指标的检测， 使同学们对临床生化检验有一个初步的了解。 实验一 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的 1. 掌握分离血清蛋白的基本原理及其临床意义。 2. 了解醋酸纤维薄膜电泳的方法及相关仪器的 操作。 二、背景与原理 血清蛋白的 pI 都在 7.5 以下，在 pH 为 8.6 的巴比妥缓 冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各 有差异。所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上 分离成 A 、 α1 、 α2 、 β 和 γ 五条区带。电泳结束后， 将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色， 再脱色（洗去多余染料）。将染色后的区带分别用 剪刀分离出来，将其溶于碱液中，进行比色测定， 最后计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后 的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘出 电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百 分数。 + 白蛋白 (A) α1 α2 β γ 血清蛋白的 pI 大多在 7.5 以下，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液中以负 离子形式存在，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离 成 A 、 α 1 、 α 2 、 β 和 γ 五条区带。 蛋白名称 等电点 分子量 白蛋白 4.88 69000 α 5.06 α1 ： 20000 α2 ： 30000 β 5.12 90000-150000 γ 6.85-7.50 156000-300000 ? 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗 透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有 用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂 蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 ? 醋酸纤维素薄膜经 1,4 －二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透 明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 醋酸纤维素薄膜的特性 四、 实验操作 1. 准备与点样： 1 ） 将薄膜切成 2.5 × 8cm 的小块，在薄膜无光泽面距一 端 1.5cm 处用铅笔划一线，表示点样位置。 2 ） 将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上 （缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。 3 ） 将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出， 用滤纸吸取多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻 片上，使点样线空架。 4 ） 用血色素吸管吸取人新鲜血清 3 ～ 5ul ，涂于宽 2 厘 米的点样器末端处，或用点样器在盛有血清的小烧杯 中蘸一下，使其末端粘上薄层血清，然后紧按在薄膜 点样线上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。 2. 电泳 : 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面 （即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以四层 滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡 5 分钟后通 电，电压为 10V/cm 长（指膜条与滤纸桥总长度），电 流为 0.4 ～ 0.6mA/cm 宽，通电一小时左右关闭电源。 3. 染色 : 通电完毕后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑 10B 的染色液中，染 5 分钟取出，立即浸入盛有漂洗液 的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用 滤纸吸干薄膜。 4. 定量： 取试管 6 支，编好号码，分别用吸管吸取 0.4N 氢氧化钠 4ml 。 剪开薄膜上各条蛋白色带，另一空白部位剪一平均大小的薄 膜条（作为分光光度法调零管），将各条分别浸于上色述试 管内，不时摇动，使蓝色洗出。约半小时后，用分光光度计 进行比色，波长 650nm ，以空白薄膜条洗出液为空白对照， 读取白蛋白、 α1 、 α2 、 β