WB的转膜和染色.docx

资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除 资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除 WB的转膜和染色 凝胶中蛋白的可视化 在现阶段染胶可用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。 如果您计划将蛋白转印到膜上，则使用 铜染色法，因为考马斯染色不可逆。考马斯染色仅适用于以下情形：在转膜后染胶检查转膜 效率；不需要转膜，只需观察 SDS结果。 考马斯染色 切断电源后，分离的蛋白条带就会开始扩散 （溶于水溶液）。为了防止蛋白的扩散，用40%蒸 馏水、10%醋酸、50%甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。 为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水 /醋酸/甲醇混合物中加入质量比 0.25%的考马 斯亮蓝R-250，然后将凝胶放置溶液中，在振荡器上室温孵育 4小时至过夜。接下来将凝胶 （保存染料；可重复多次使用）转移到67.5%蒸馏水、7.5%醋酸、25%甲醇的混合溶液中， 放置在振荡器上，洗去多余的染料。 染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白 紧密结合，显示为深蓝色。 铜染色法 用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶 （最多30分钟），然后转移至0.3 M CuCI 2溶液染色5-15分 钟。接下来用去离子水简单清洗凝胶， 在暗视野背景下观察。蛋白在半透明蓝色背景下形成 清晰条带。凝胶可以用 0.1 -0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 重复冲洗至完全脱色。根据转 膜仪器制造商的说明，进行转膜。 转膜 转膜流程的详细说明可在转膜仪器制造商的网站上找到， 根据系统的不同而有所区别。 但是， 每种方法的原理都一样。 带电荷的蛋白（SDS提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转 移到膜上，显示蛋白的 印迹”早期的方法依赖于扩散； 现在在电场中进行印迹是标准方法 了。 转膜可以湿转或半干转。 湿转由于膜的干燥而更不容易失败， 尤其推荐用于大蛋白转膜。 在 两种转膜方法中，膜都放置在凝胶旁边， 两者夹在滤纸中间，整个三明治结构夹在固体载体 之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。 在湿转中，凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之间 （海绵 滤纸 凝胶 膜 滤纸 海绵）， 确保凝胶与膜之间不形成气泡。 三明治结构浸泡在转膜缓冲液中， 对其施加电场。负电荷蛋 白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。 湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是 1x Tris-甘氨酸缓冲液，但是没有 SDS，并加入 了甲醇至终浓度20%。对于分子量大于100 kDa的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度 为 0.1% 的 SDS。 只供学习与交流 资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除 资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除 只供学习与交流 只供学习与交流 在半干法转膜中，三明治由滤纸 凝胶 膜 滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置 在正负电极之间。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。 半干转的转膜缓冲液中 Tris和甘氨酸的比例不一定与湿转一致， 请参考仪器制造商的实验方 案。标准配方是 48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04% SDS、20%甲醇。 有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（ NC膜）和PVDF膜，实验效果都很不错。 PVDF膜要求 进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡 1 -2分钟。之后转移膜至冰冷的 转膜缓冲液中孵育 5分钟。未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。 小分子和大分子蛋白的转膜 转膜缓冲液中SDS和甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以 增加转膜效率： 大分子蛋白（100 kD） 对于大分子蛋白，其在凝胶电泳时分离迁移较慢， 从凝胶中转膜也很慢。 因此跑胶时应该使 用低浓度的凝胶，8%或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。 大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集， 阻碍转膜。在转膜缓冲液加入终浓度 0.1%的 SDS,可以避免出现这种情况。由于甲醇易使 SDS从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至 10%或更低，可以防止蛋白沉淀。 降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。 只有使用NC膜时才必需使用甲醇。如果是 PVDF膜，在甲醇激活膜后，转膜缓冲 液中可以不加入甲醇。 选择湿转4°C过夜，不建议选择半干转。 小分子蛋白（100 kD） SDS妨碍蛋白与膜的结合，对于小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲 液中可以不加 SDS。 保持甲醇的浓度20%。 对于500 kD的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统： Bolt MW and Maho ney PA （1997）.High-efficie ncy blotti ng of prote ins of d