生理指标测定实验方案汇总.pdfVIP

预测指标： 1.抗氧化酶系统、 MDA 2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基 3.叶绿素、类胡萝卜素 4.可溶性糖 5.游离氨基酸 6.过氧化氢 7. 谷胱甘肽、 ASA 1. 抗氧化酶系统、 MDA A 酶活测定 试剂： PBS缓冲液 0.05M（pH 7.8 ）：取 0.663g NaH2PO4·2H2O和 16.384g Na2HPO4·12H2O，加 PVP10g， 并加 EDTA或者 EDTA盐，使其浓度为 2mM，加蒸馏水定容至 1L。用前冰箱或冰上预冷。 样品制备 鲜样 0.1-0.5g 加入 1 ml 磷酸缓冲液（ 0.05M ，pH 7.8 ），稍许石英砂，研磨成匀浆；移入 10 ml 离心管中，再用 4ml 磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中； 10000×g 4 ℃ 下离心 20 min ；上清夜贮于 4 ℃冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份 (0.1g 左右 ) 烘干称重。 SOD （λ=560nm） 试剂配制： 1LPBS Met 1.93973g 缓 冲 NBT [ 氮蓝四唑 ] 0.061323g 液 中 EDTA-Na2 0.0037224g 加入 核黄素 0 实验步骤： 2.725mL 反应液＋ 250uL 蒸馏水＋ 25uL 酶液 【样品管】 2.75mL 反应液＋ 250uL 蒸馏水（光照作为 100%CK） 【照光对照管】 2.75mL 反应液＋ 250uL 蒸馏水（黑暗作为调零） 【空白调零管】 4000lx 日光灯下反应 20 分钟， 560nm 比色。反应温度 25~35℃。 已知 SOD活性单位以抑制 NBT光化还原的 50 ％为一个酶活性单位表示按下式计算 SOD活性： SOD总活性＝（ Ack －AE）*V/ （0.5*Ack*w*Vt ） （式中 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示， Ack 为照光对照管的吸光度， AE 为样品管的吸光 度， V 为样品液的总体积 ml ，Vt 为测定时样品用量 ml ，w 为样品鲜重 g ） ※※※【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。 【样品管】 和【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。 POD （λ=470nm 比色） 试剂配制： 1.5%愈创木酚（ 1.5ml 愈创木酚，用蒸馏水定容到 100 ml ） 300uM的 H2O2：取 30％的 H2O2 1.53ml ，用蒸馏水定容到 50 ml ； 实验步骤： 100ul 酶液 +2700ulPBS+100ul 愈创木酚 +100ul H2O2，于普通比色皿，轻轻摇匀 2- 秒， A470 动力学测定 1 分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为 activity ，此后测定均参考该时间 段。 结果计算： POD(mmol/g)=activity ×A×V ×a/(E ×w) A 反应液总体积 /ml ；V 提取液总体积 /ml ；a 测定液体积 /ml ；w 材料鲜重 /g ；E 吸光系数 /mM ·cm-1 CAT （240nm 比色） 试剂配制： 300uM 的 H2O2：取 30 ％的 H2O2 1.53ml ，用蒸馏水定容到 50 ml ； 实验步骤： 100ul 酶液 +2800ulPBS+100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀 2- 秒， A240 动力学测定 1 分 钟。选择时