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等电点聚焦电泳仪：关于等点聚焦不得不看的知识点 　等点聚焦电泳主要是依据不同的蛋白质分子等电点不同而对蛋白质进行分离的技术。本文主要等点聚焦电泳中对电聚焦的优缺点、等点聚焦原理、仪器与试剂、两性电解质、密度梯度等电点聚焦等方面进行描述。 　一、电聚焦的优缺点： 　电聚焦的优点是：有很高的分辨率，可将等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质分开;一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走的距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，使区带越走越窄;由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其电点，很稀的样品也可进行分离;可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01pH单位。电聚焦技术的缺点是：一是电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，二 是样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。 　电聚焦技术要求有稳定的pH梯度，要求极防止对流和防止已分离区带再混合的措施，其办法有三：密度梯度，聚丙烯酰胺凝胶和区带对流聚焦，以第一种方法为常用。 　二、基本原理 　等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 　(1)人工pH梯度：在分离蛋白质时常用一个直立的性，以蔗糖密度梯度防止对流。当两个不同pH的缓冲液互相扩散时，在其混合区间即形成pH梯度，称为“人工pH梯度”。因为缓冲液是电解质，在电场中的它的离子移动会引起pH梯度的改变，所以不稳定。 　(2)天然pH梯度：这种梯度是由电流本身所引起并保持的，比较稳定，其形成过程是，当电解硫酸钠的稀溶液时，在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。若将一些两性电解质放入槽中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电，这样就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质(甲)，当它由阴极逐渐接近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动，(甲)所在的位置就是它的等电点，另有一个等电点稍高于(甲)的物质(乙)，当向阳极运动靠近(甲)时，它不能超过(甲)，因为那里低于它的等电点。于是(乙)将带正电荷而向阴极移动，它只能排要(甲)的阴极侧。假如有很多两性电解质，它们就会按照等电点由低到高的顺序依次排列，形成一个由阳极向阴极逐步升高的平稳的pH梯度，此梯度的进程取决于两性电解质的pH值，浓度和缓冲性质。防止对流的情况下，只要电流稳定，这个pH梯度将保持不变。 　(3)两性电解质互相分离的条件：上述经验甲乙两物质形成两个相邻的不同pH的等电点层，因为在它们中间不能形成纯水层，所以它们不是完全分离开的，中间部分互相扩散，互相粘连。要使两物质完全分开，中间必须有一个介于其间pH值的物质，例如，当甲乙两物质的pH值正好一个在7以下，一个在7以上，即可以分开，因为中间形成了纯水层(pH=7)，这时水是作为一个两性电解质而存在。 　(4)蛋白质的电聚焦分离：蛋白质及多肽是两性电解质，它们比氨基酸更适于电聚焦，因为它们在等电点附近仍有电荷而能进行电迁移，大部分中性氨基酸在接近等电点时就失去电荷而停止运动，不能过到真正的等电点。但在没有第三种居间的两性电解质存在时也不能将两种蛋白质完全分开，必须有很多不同pH值的是电解质(载体两性电解质)才能解决这个问题。 　三、仪器与试剂 　1.材料：蛋白样品 　2.试剂： 　聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100 　电极液：1M磷酸(阳极液)、1M氢氧化钠(阴极液) 　固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 　染色液：0.35g考马斯亮蓝R-150溶于300ml脱色液中，加热到60-70℃，加入0.3g硫酸铜。 　脱色液：25%乙醇、8%冰乙酸溶于水 　样品缓冲液:1%Ampholine 、2%Triton X-100、9M尿素 　四、载体两性电解质 　(1)载体两性电解质必需具备的条件： 　(i)在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程。 　(ii)在等电点必需的足够高电导，以便使一定的电流通过，而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀，如果有局部电导过小，就会产生极大的电位降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。 　(iii)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。 　(iv)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。 　(v)应不与分离物质反应或使之变性。