实验一大肠杆菌感受态制备及外源的转化.ppt

超净工作台 离心设备 台式高速冷冻离心机 恒温空气摇床 恒温培养箱 培养皿 实验试剂   大肠杆菌DH5α   LB培养基，   0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）   氨苄青霉素 pUC18质粒 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 实验步骤 感受态细胞制备 4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min 5．4000rpm离心5min,弃上清 6．加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 7．4000rpm离心5 min,弃上清 8．加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15％的甘油 可－70℃长期保存 实验步骤 转化 9．    取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10．  于42℃水浴90S 11．  冰上放置2min 12．  加入800μlLB液体培养基于37培养1小时 13．  将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14． 将平板放置于37℃恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果 对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。  对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数  实验结果 实验报告 写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂 详细列出实验步骤； 画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。