显微操作技术荧光显微镜技术的特点和应用解读.ppt

荧光显微镜技术的特点和应用 荧光显微镜的种类 ? 透射式 ● 落射式 ? 和传统显微技术相比 , 荧光显微技术具有以下优点 : (1) 荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的 波长短 1/2, 因此荧光显微镜的分辨能力超出了传 统显微镜的分辨率的极限 (2) 荧光显微镜技术具有高度灵敏性和专一性 . 它所 用染料的量是极其微小的 , 只相当于传统显微技术 中染料消耗量的几千分之一 . ? (3) 荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成 分 , 并且显示的彩色效果很明亮 , 极易观察 , 极易进 行定量分析 , 而且能以极低浓度的染料检测出含量 极微的物质 . ? (4) 随着新的荧光染料的发明 , 可不断扩大被测物 质的范围 . ? 生物学材料，有各种产生荧光 : 1. 自发荧光 : 或原发荧光 细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产 生荧光 2. 诱发荧光 材料中的某些物质经一定的化学处理后，可 转化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见 的是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化 为荧光色团。戊二醛也能诱发荧光 ? 3 荧光染料染色： 应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物 组织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即 可被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。 许多常规染色剂 ( 如刚果红、曙红、碱性品红、水 溶性苯胺蓝等 ) 兼有荧光染料的性能 1.DNA 研究 ? 用细胞荧光测定技术测量 DNA, 是荧光显微技术和 细胞光度技术相结合的产物 , 标志着前者由定性向 定量测定发展 . 吖啶橙 ? 3 ， 6 －（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式 C17H19N3 · HCl · ZnCl ? , 分子量 438.12g/mol, 是一种荧光 色素 ，其检测激发滤光片波长 488nm, 阻断 滤光片 波长 515nm 。 吖啶橙 ? 染色原理 : 吖啶橙可对细胞中的 DNA 和 RNA 同时染 色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为 492nm ，荧 光发射峰为 530nm （ DNA ）、 640 （ RNA ），它与双 链 DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光 （ 502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约 530nm ），胞质 RNA 发橘红色荧光（ 580nm ）。 ? 它与 细胞 中 DNA 和 RNA 结合量存在差别，可发出不 同颜色的 荧光 ，与 DNA 结合量少发绿色荧光，与 RNA 结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有 膜通透性，能透过细胞膜，使核 DNA 和 RNA 染色。 因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常 细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光。 体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色 可见含 DNA 的细胞核显示黄绿色荧光，含 RNA 的细胞质显示橘红色荧光 DAPI ? DAPI 即 4,6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (4,6- diamidino-2-phenylindole) ，是一种能够与 DNA 强力 结合的 荧光染料 ，最大吸收波长为 358nm ，最 大发射波长为 461nm 。 DAPI 染色原理： DAPI 为一种 荧光染料 ，可以穿透细胞膜与 细 胞核 中的双链 DNA 结合而发挥标记的作用，可以产 生比 DAPI 自身强 20 多倍的荧光，和 EB 相比，对双链 DNA 的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到 显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察 细胞标记 的效 率高 ( 几乎为 100 %) ，且对活细胞无毒副作用。 2. 细胞壁研究 荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出 方面 , 是用于鉴定细胞壁成分 , 研究壁形成和再生 , 以及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化 观察细胞壁的方法很多 , 如用专一的染料染色 或利用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方 法是荧光增白剂染色 , 在 4QOnm 左右的激发光照射下 观察细胞壁 ( 纤维素 ) 所产生的绿色荧光来判断细胞 壁的有无 荧光增白剂染色 ? 荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力 , 当前常用 的荧光增白剂有 ST,M2R,VBL.ST 开始被用于显示细 菌 , 放线菌与真菌的细胞壁 , 在粘菌材料中 , 它被证 明与纤维素和几丁质有亲和力 ? 胼胝质是一种以β -1,3 键结合的葡聚糖。在植物 的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重 要的调节作用，其合成、分