HE染色实验技术及注意事项.ppt

HE染色试验技术及注意事项 HE染色又称苏木素-伊红染色法，是普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的一种染色方法。 报告内容 HE染色原理 试剂 染色步骤 注意事项 几种常见的染色问题 HE染色原理 试剂 苏木素染液（细胞核着色） 盐酸乙醇分化液 稀氨水 伊红染液 二甲苯 梯度浓度乙醇 染色步骤 注意事项 （1）脱蜡。切片脱蜡后才能染色，且脱蜡应彻底。脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，如果二甲苯是用过一段时间，切片又比较厚，室温低应增加脱蜡时间，脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。 （2）染色。根据实际情况，通过预实验得到最佳染色时间。一般情况下新配的苏木素染液中只需染1~3min 左右，应根据染片的多少，逐步把染色时间延长。分化时间不易过长，分化应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木素染液中染色，在水洗分化和使切片在自来水或稀的氨水中充分变蓝（蓝化）。新配的伊红染色块，切片染色不易过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片使伊红染后，分化时间要短。 （3） 脱水。染色后通过各级酒精脱水，从低浓度到高浓度。低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时要短，向高浓度逐渐延长脱水时间，脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。 （4）透明与封片。切片染色脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。应引起注意的是，二甲苯纯度不纯使切片透明不够，会影响切片质量。 几种常见的染色问题 脱蜡： 染色： （1）苏木素染色 （2）伊红着色 封片： 谢谢！ * * 苏木素 苏木红 蓝色色精 分化和蓝化 氧化 +铝 细胞核 负电荷色酸 （染料有色部分） 伊红 染色 染色 正负电荷的 极性吸附 正电荷色酸 （染料无色部分） 水解 渗透作用或者弥散作用完成 常规脱蜡 苏木素染色（5-15min），水洗 盐酸乙醇溶液分化（30s），水洗 伊红染色（1-3min），水洗 氨水反蓝（30s），水洗 90%乙醇（5min） 80%乙醇（30s） 100%乙醇（2次×10min） 二甲苯（3次×5min） 封片 染色 脱水 透明 封片 脱蜡 染色的时间，应根据室温，及组织的具体情况来确定，做之前做预实验。 切片中白色的区域脱蜡不彻底，染色液由于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。 原因：①烤( 烘) 片温度太低，脱蜡前没有充分烤( 烘) 干。 ②二甲苯脱蜡时间不足， 或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。 对策：①用无水乙醇去掉玻璃片上的水分，重新二甲苯脱去石蜡。 ②切片需退回到脱蜡步骤，延长脱蜡时间，或跟换二甲苯，驼色、漂白、重新染色。 原因：染色时间短；苏木素过度氧化，失去染色能力；分化时间过长。 苏木素染色太浅，细胞核与细胞质颜色对比度差。 对策：切片重新染色。 细胞核过染， 核膜、核仁等不清晰， 细胞质( 尤其是皮肤上皮细胞) 含有大量的细胞核染色液苏木精， 导致细胞核与细胞质比例失调。 原因：与图2相反，染色液时间过长、切片太厚、分化步骤时间太短。 对策：如果切片不是因为太厚，脱色、漂白、重新染色， 对于染色和分化时间做些适当的调整。若太厚则需要重新切片。 切片细胞核棕色， 表明苏木精没有充分蓝化， 或苏木精过度氧化失去染色能力 原因：苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。 对策：染色前检查苏木精染色液的染色能力，过渡氧化，应及时更换。其次，在苏木精染色后， 给切片以足够的蓝化时间。 染色后有杂质 原因：苏木精染色液中的金属膜，黏附在玻片上。 对策：每天染色前仔细过滤苏木精染色液，或建议使用半氧化苏木精染色液。 切片中央区域伊红染色不均匀， 可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染所致 原因：伊红染液的pH 值可能大于5 ；也可能是蓝化液残留过多；切片太薄；或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。 对策：检查伊红染液的pH值，用乙酸将其调节在4.6-5.0 之间，使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后，用自来水冲干净。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长， 因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。 原因：伊红染色液浓度太高；切片在伊红染色时间过长；切片在伊红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快， 而使乙醇分化伊红的作用不能产生。 对策：适当稀释伊红染色液，减少伊红染色时间，或者使切片在乙醇脱水等步骤时，停留时间相对均匀。同样， 也要检查切片的厚度是否合适。 伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次，缺乏对比 在显微镜下呈现大量水珠或云雾状改变 原因：切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水， 导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。也可能是封片的时候出现的气泡。 对策：移去盖玻片， 用二甲苯溶解封