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戊二醛二步交联法制备酶标抗体 戊二醛二步交联法制备酶标抗体 戊二醛二步交联法制备酶标抗体 戊二醛（glutaraldehyde，GA）：是一种常用的同型双功能交联剂，它的两个醛基可分别与HRP和抗体蛋白的氨基形成Schiff碱（-N=C-），将他们以五碳桥连接起来。戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4-40℃范围，pH6.0-8.0的缓冲液中进行。另外，GA缩合体使被结合的蛋白分子与分子之间的间隔延长，可免于使蛋白分子的三级结构发生改变。 (1) 用0.05mol/L， PH9.5碳酸盐缓冲液(CBS)将25%戊二醛稀释至5%； (2) 称取5mgHRP 溶于0.5ml 5%戊二醛，37℃水浴结合2h； (3) 加入220.0g/L NaCl 0.1ml， 充分混匀后，置4℃10min预冷； (4) 加冷无水乙醇2.4ml，颠倒混合，立即1000r/min离心10min； (5) 弃上清，沉淀用冷80%乙醇洗一次，将离心管倒置，控干； (6) 加入0.05mol/L， PH9.5 CBS 0.5ml溶解沉淀物； (7) 将5mg抗体溶于0.5ml 0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液混合； (8) 加入1.0mol/L， pH9.5 CBS，调节pH值至9.0-9.5； (9) 于4℃，电磁搅拌下结合24h； (10)加入0.1ml O.2mol/L赖氨酸，以封闭残留的醛基，终止反应； (11)4℃放置2h； (12)将反应物通过Sephadex G-200凝胶柱，用PBS洗脱，收集第一洗脱峰；或将反应物装入透析袋，对0.01mol/L，pH7.2 PBS，4℃透析过夜并收集； 即为酶标记抗体。 (1) 所用的戊二醛A235/A280为10左右，未经蒸馏等处理。 (2) 酶的醛化时间37℃2h、4h和4℃16h无明显区别。 (3) 醛化时，使用的缓冲液以CBS为宜。 (4) 加入220.0g/L NaCl 的目的主要是提高离子强度，以便乙醇沉淀。 (5) 根据有关文献的报道，用50%饱和硫酸铵盐析或Sephadex G-200凝胶柱层析，对于ELISA检测并无实际意义，并常使酶与抗体的活性大量丧失，且这两种纯化法不能去除未标记的抗体，需用ConA-Sepharose 4B纯化才能达到，因此，在常规工作中，盐析和过柱的纯化步骤可以省略.