基因表达与蛋白质纯化技术探讨.pptx

复旦大学生物化学系 黄伟达 whuang@fudan.edu.cn 2004年5月18日 ;内 容;基因工程的应用领域;基因表达体系;大肠杆菌 (Escherichia coli);枯草杆菌 (Bacillus subtilis);其 他;真核细胞表达体系;酵母细胞;昆虫细胞;CHO细胞;植物组织;动物乳腺组织;鸟类输卵管组织;体系选择; 在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素? 在大肠杆菌中生产人凝血IX因子? 在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽? 在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰? 在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化? 在鸡输卵管中进行与???乳动物细胞一致的糖基化? 提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性? 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化;在大肠杆菌中表达外源基因;按蛋白质类型分 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽 按启动子分 lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导;pJLA50X系列; pcDNAII; etc pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) pBAD系列 (Arabinose诱导型);Protein A GST（glutathione S-transferase） CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene) MBP (maltose-binding protein) GFP (green fluorescence protein) Thioredoxin **帮助二硫键形成 Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) ** 二硫键的形成与 SUMO (small ubiquitin-related modifier) KSI (ketosteroid isomerase) 基本上全部沉淀;His-tag (6-8 Histidine) T7-tag (MASMTGGQQMG) HSV-tag (QPELAPEDPED) S-tag (KETAAKFERQHMDS) VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK) HA-tag (YPYDVPDYA) Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL);Biotinylation-tag 100多AA的结构域, 在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invitrogen的pET104-DEST. 未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯) 未命名 一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞;DTT: intein的↓Cys 溴化氰: Met↓ Thrombin: LVPR↓GS Factor Xa: IEGR↓ Enterokinase: DDDDK↓ PreScissionTM protease: