细胞表型实验.pdf

细胞表型实验 前提： 设计实验组和对照组 目的：研究肿瘤细胞表型特征或在特定情况下 （相关基因或蛋白改变） 肿瘤细胞的表型变化。 内容： 细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、迁移、趋化、增殖、生长等。 1. 细胞凋亡 ? 概念： 是指细胞在一定的生理或病理条件下， 受内在遗传机制的控制自动结束生命的过 程。 ? 实验方法：检测试剂盒和细胞流式。 ? 注意点：进行细胞凋亡实验时，要用不含 EDTA的胰酶进行消化。 磷脂酰丝氨酸（ PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期， PS可以从细胞膜的内 侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境。 Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合 蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin V 进行荧光素 FITC 标记可以用流式细 胞仪进行检测。胰酶中的 EDTA能够螯合钙离子，从而削弱 Annexin V 结合效率，对凋 亡实验造成不可控影响。因此实验时，需要另外购买不含 EDTA的胰酶，不能直接使用 实验室现有的胰酶。 2. 细胞迁移 ? 目的：测定肿瘤细胞的运动特性方法之一。 ? 原理：体外培养单层细胞，人为制造空白区域——“划痕” ，细胞逐渐进入空白区使划 痕愈合。 ? 实验方法： 1） 培养板接种细胞之前先用 marker 笔在培养板背面画横线标记（方便定位同一个视野） 。 2 ） Day1, 种板，数量以贴壁后铺满板底为宜（也可在划痕前做其它处理如转染、感染） 。 3） Day2，细胞铺满板底后，用 10ul 枪头比着直尺，垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证 各个划痕宽度一致。 4 ） 用 PBS冲洗孔板三次，去除划痕产生的细胞碎片，加入有血清 / 无血清培养基。 注意点： 根据不同细胞系的贴壁情况，选择是否立刻用 PBS清洗。例如转染后的 huh7 细胞 系划痕后易飘起。 关于有血清 / 无血清培养基的选择：当划痕实验周期比较短的时候（小于 48h ），或 者不考虑增殖对实验造成的影响，可以用有血清培养基培养。当划痕实验周期比较 长的时候，用无血清或者低血清或者用放线菌酮抑制细胞增殖。 5） 将培养板放入培养箱培养，每隔 8-12 小时（至少一天 2 次）取出拍照。 例如 RBE细胞隔 6 小时拍照，拍照间隔和拍照时间要根据不同细胞系决定。 6） 根据收集的图片，分析实验结果，将实验结果量化。 Note ：用 AI 量化结果，建议比较划痕间的距离而非面积。 3. 细胞生长和增殖 克隆形成 ? 克隆的概念：单个细胞在体外增殖 6 代以上（ 1week），其细胞形成的细胞群体。 ? 目的：克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 （贴壁后的细胞不一 定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。 ） ? 实验方法： 1） 取对数期生长的细胞，计数种板。 2 ） 当培养皿中出现肉眼可见的克隆时 (3mm)，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗 2 次。加甲醇固定 15 分钟。然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色约 15 分钟，然后用 流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 Note ：细胞增殖慢且细胞数少时，注意补液，如 hu