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SDSPAGE电泳注意事项 SDSPAGE电泳注意事项 PAGE / NUMPAGES SDSPAGE电泳注意事项 SDS是阴离子去污剂，作为 变性剂和助溶试剂 ，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去 折叠，损坏蛋白分子的二、三级构造。 强复原剂如 巯基乙醇 ，二硫苏糖醇 能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。 在样品和凝胶中加入 复原剂和 SDS 后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和 SDS 联合成 蛋白 - SDS胶束，所带的负电荷大大超出了蛋白原有的电荷量 ，这样就 除去了不一样分 子间的电荷差异和构造差异。 浓缩胶的作用 是有聚积作用， 凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁徙作用而被 浓缩至一个狭小的区带。 聚丙烯酰胺凝胶由 单体丙烯酰胺 和甲叉双丙烯酰胺 聚合而成，催化聚合的常用方法有两种： 化学聚合法 和光聚合法 。化学聚合以 过硫酸铵（ AP）为催化剂 ，以 四甲基乙二胺（ TEMED） 为加快剂。 不连续系统由电极缓冲液、 浓缩胶及分别胶所构成。 浓缩胶 是由 AP 催化聚合而成的 大孔胶 ， 凝胶缓冲液为 的 Tris-HCl。分别胶 是由 AP 催化聚合而成的 小孔胶 ，凝胶缓冲液为 Tris-HCl。 电极缓冲液是 Tris-甘氨酸 缓冲液。 2 种孔径的凝胶、 2 种缓冲系统、 3 种 pH 值使不连续体 系形成了 凝胶孔径、 pH 值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要要素。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳常常应用于 提纯过程中纯度的检测 ，纯化的蛋白质往常在 SDS电 泳上应只有一条带， 但假如蛋白质是由不一样的亚基构成的， 它在电泳中可能会形成分别 对应 于各个亚基的几条带。 注意问题 1.样品办理 上样缓冲液的作用 ：形成 SDS-蛋白复合物，使其带负电； SDS和巯基乙醇 使蛋白质解离，综 上两点为了在电泳中，只依据分子量来分别。 SDS作用 ：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、撤消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折 叠， 还有助溶剂的作用 。 SDS电泳凝胶中各主要成分的作用 （1）浓缩与分别胶凝结的利害直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境亲密有关。 提升 SDS电泳分辨率的门路 待凝胶在室温凝结后，可在室温下搁置一段时间使用。 忌即配即用或 4 度冰箱搁置 ，前者 易致使凝结不充足，后者可致使 SDS结晶。一般凝胶可在室温下保留 4 天， SDS可水解聚丙 烯酰胺。 4. .“ 浅笑”（两边翘起中间凹下）形带原由 主假如因为凝胶的 中间部分凝结不平均所致 ，多出现于较厚的凝胶中。 办理方法：待其 充足凝结 再作后续实验。 “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原由 主要出此刻蛋白质垂直电泳槽中， 一般是两板之间的底部空隙气泡未清除洁净。 办理方法：可在两板间加入适当缓冲液，以清除气泡。 带出现拖尾现象 主假如样品融解成效不好或分别胶浓度过大惹起的。 办理方法： 加样前离心； 选择适合的样品缓冲液， 加适当样品促溶剂； 电泳缓冲液时间过长，从头配制；降低凝胶浓度。 带出现纹理现象 主假如样品不溶性颗粒惹起的。 办理方法：加样前离心；加适当样品促溶剂。 溴酚蓝不可以起到指示作用 实验中常会碰到溴酚蓝已跑出板底， 但蛋白质却还未跑下来的现象。 主要与缓冲液和分别胶 的浓度有关。 办理方法：改换正确 pH 值的 Buffer ；降低分别胶的浓度。 电泳的条带很粗 电泳中条带很粗是常有的事，主假如未浓缩好的原由。 办理方法：适合增添浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的 pH 正确（）；适合降低电压； 电泳电压很高而电流却很低呢 比方电压 50v 以上，可电流却在 5mA 以下。主假如因为电泳槽没有正确装置，电流未形成 通路。包含： a.内外槽装反； b.外槽液过少； c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比方倒胶用的 橡胶皮）。 浓缩胶与分别胶断裂、板间有气泡对电泳影响 一般对电泳不会有太大的影响。 前者主要原由是拔梳子使劲不平均或过猛所致； 后者是因为 在排除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入惹起的。 12. 凝胶时间不对，或慢或快 往常胶在  30MIN-1H  内凝。假如凝的太慢，可能是  TEMED， APS 剂量不够或许无效。  APS 应当现配现用，  TEMED 不稳固，易被氧化成黄色。  假如凝的太快，可能是  APS 和  TEMED 用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 13. 电泳时间比正常要长 可能因为凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误，即缓冲系统地 PH 和被分别物质的 等电点差异太小，或缓冲系统的离子强度太高。 分别胶加上后为何要 立刻 加水 加入分别胶后，立刻覆一层双蒸水， 一是为了使分别胶界面保持水平，