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动物医学本科毕业论文 浅析动物转基因研究进展 摘要 物转基因技术是一项新的生物学技术，可 应用于畜牧业及生物 医学等领域。对转基因动物的制作方法及应用进行了综述，对其 发展趋势进行展望，以促进动物转基因研究的开展。 关键词 基因动物;畜牧业;生物医学 动物转基因技术是20世纪80年代初发展起来的一项新的生物技术，该技术克服了动物物种之间固有的生殖隔离，实现了不同物种之间遗传物质的交换和重组。经过科学 工作者多年的努力，转基因研究已经取得许多开创性的成果，在基础生命科学、医学以及农学等一系列领域中展现出非常广阔的应用前景，备受各国科学家的关注。该文对转基因动物的制作方法及应用进行概述，对转基因技术存在的问题进行分析，并对动物转基因的发展趋势进行展望。 1制作转基因动物的方法 转基因动物是指那些通过导入外源DNA片段，继而在其染色体组上稳定整合并可遗传给后代的动物，是重组DNA技术和胚胎技术发展的必然结果。制作转基因动物的方法主要有原核显微注射法、胚胎干细胞法、转基因体细胞克隆法、病毒载体法等。 1.1原核显微注射法 原核显微注射法是将表达载体直接注射到受精卵原核内部，需要专业的显微操作设备，是经典的转基因动物制备方法[1]。1980年Gordon等[2-3]利用显微注射法成功获得转基因小鼠，并且外源基因能够稳定整合和遗传。1982年Palmiter等[4]构建了金属硫蛋白MT启动子驱动的大鼠生长激素基因重组表达载体，将其显微注射到小鼠原核期胚胎，获得了含有外源生长激素基因的体型巨大的超级小鼠。随后，Hammer等[5]利用该方法成功地制作了转基因兔、绵羊和猪，被认为是动物转基因研究历程上的里程碑。然而，显微注射法中外源基因整合的拷贝数和整合位点都是不确定的，当外源基因整合到染色体组的非活跃区时，会产生位置效应，导致其低表达或不表达;同时，该方法生产转基因动物的效率低，后代嵌合体比例高，尤其是大动物，受体需要量大，风险大，造成大型动物制备的成本高，极大地制约着转基因动物的产业化。 1.2病毒载体法 病毒载体法主要包括慢病毒/逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒及在此基础上改造的假型病毒等，该文主要介绍慢病毒/逆转录病毒载体法。 逆转录病毒是RNA病毒，包括白血病病毒及艾滋病病毒等，可以感染哺乳动物并引起多种疾病，如疱疹、癌症、免疫缺陷综合症等。病毒感染细胞后，病毒RNA进入细胞并转换为DNA分子，然后比较容易地整合到宿主细胞基因组内，故逆转录病毒是有效的转基因载体。1975年Jaenisch等[6]利用鼠莫洛尼氏白血病病毒Moloney leukemia virus，M-MuLV感染小鼠胚胎，成功地制备转基因动物。Rogers等[7]采用禽白血病病毒感染早期的鸡胚胎，得到转基因鸡，Haskell等[8]人应用该方法获得转基因牛。然而简单的逆转录病毒载体法有一定的局限性，如外源基因只能与分裂期细胞基因组整合，只对部分细胞具有侵染性，不能感染合子期单细胞，易形成嵌合体转基因动物等，逆转录病毒科中的慢病毒可以部分克服上述缺点。2021年Golding等[9]使用慢病毒载体法制备抑制朊病毒蛋白质表达的转基因山羊;2021年Gómez等[10]获得了人表皮生长因子受体转基因克隆猫，Ramsoondar 等[11]获得了表达小干扰RNA的转基因猪，Sasaki等[12]成功获得含GFP标记基因的转基因狨猴。上述研究表明，由逆转录病毒/慢病毒载体携带的外源基因不仅在多种器官 组织中表达，并且可稳定遗传。 慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗中载体研究的 热点。然而其携带的外源基因一般小于10 kb，因是随机整合，故易引起插入突变，其LTRs可能干扰哺乳动物启动子，转基因动物可能是嵌合体。另外，慢病毒载体的安全性一直是人们关注的热点问题，上述问题将制约其在转基因产业化进程中的应用。 1.3胚胎干细胞转染法 从早期小鼠胚胎中获得的胚胎干细胞Embryonic Stem Cell，ES[4]，可在滋养层或条件培养基中培养，将外源基因重组载体转染ES细胞获得转基因ES细胞，再将其注射进囊胚，并将感受态囊胚移植进假孕母鼠的体内，获得嵌合体转基因小鼠。经过常规育种扩繁技术，最终得到可稳定遗传的转基因小鼠新品系。该方法的最大优点是通过同源重组构件的转染，进行基因打靶，可精确定位外源基因整合位点，解决了原核显微注射随机整合的难题。小鼠胚胎干细胞制备技术已经成熟，而家畜是否具有胚胎干细胞及其ES细胞的分离、培养等还在探索中。因此，该方法主要用于小鼠转基因动物模型的制备。