两种致病真菌Botryosphaeria dothidea和Alternaria alternataT.pdfVIP

本文是浙江省自然科学基金项目 “一个梨轮纹病菌致病性相关的基因的克隆与功能分析 的部分研究成果 (项目编号：LYl5C140001) 课题主持人：王洪凯副教授 (浙江大学) 万方数据 两种致病真菌 (Botryosphaeriadothidea和Alternaria alternata) T-DNA突变体库的建立与分析 摘要 由葡萄球座菌 (Botryosphaeria dothidea)及链格孢 (Alternaria alternata)引发的病 害在世界范围内流行，也是影响我国水果生产的两大主要病害，给我国水果生产造成巨 大的经济损失。目前，对于该两种病原菌的研究仍处于初级阶段。虽对AM毒素 (AM．toxin)合成基因的研究取得一些进展，但对其他相关基因及功能的研究仍较为缺 乏。农杆菌介导的T=DNA随机插入突变法是目前应用于植物和真菌基因功能研究中常 用且有效的方法。为能够尽早的揭示丑dothidea及A ．alternata与寄主之间的互作关系， 开展致病相关基因的研究，本研究旨在建立农杆菌介导的T-DNA转化体系，初步构建 起两种致病菌的突变体库，并对部分突变体菌株进行分析，以获得一些性状差异显著的 菌株。主要结果如下： 1、成功构建了农杆菌介导的盈dothidea原生质体遗传转化体系，转化效率为220 株 ／106个原生质体：筛选获得901株突变体，初步建立了厦dothidea突变体库，PCR验 证eGFP基因及抗潮霉素B基因均成功整合到最dothidea基因组中。 2、对120株突变体菌株表型分析发现，43．3％的突变体菌株色素沉积加深，14．2％ 的菌株色数沉淀减弱i对其生长速率测量发现，59．3％的突变体菌丝生长速率加快，仅 有6．2％的菌丝生长速率有较为明显的减慢。 3、对500个突变体菌株致病性检测，筛选获得16株致病性明显减弱的菌株，占供 试突变体菌株的3．2％。 4、构建了链格孢苹果致病型农杆菌介导的孢子转化体系，优化了转化程序，以培 养36．48 h所产孢子4℃处理6 h用于转化，转化效率为200株／106个分生孢子。 5、筛选获得880个突变体，初步构建起链格孢苹果致病型XP．1菌株突变体库，通 过PCR检测及Southern blot杂交分析，抗潮霉素B基因成功整合到病原菌的染色体中， 且多数为单拷贝插入，单拷贝率达63．6％。 6、对100个突变体菌株进行致病性检测，筛选获得7个致病性显著下降的突变体。 关键词：Botryosphaeriadothidea；Alternaria alternata；农杆菌介导；突变体库 万方数据 Construction and Characterization of Two Respective T-DNA lnsertionalMutation Population for Two Pathogens Fungus， Botryosphaeria dothidea andAlternaria alternata Abstract The two worldwide fruit tree pandeIIlics，caused respectively by Botryosphaeria 如砌fdea and Alternaria alternata．are two major diseases that affect the production of fruits in China，resulting in huge economic loss．Currently only preliminary studies were conducted on these two pathogens．Although there are some pr