克隆载体体外重组DNA实验中.ppt

第三章 基因工程载体 Vectors for molecular cloning;1. 载体 （Vectors）; （1）在宿主细胞内能稳定存在，自主复制, 具有ori。; 基因工程中常用的载体有5类： ;载体的功能：;第一节 质粒载体 ;1、质粒的复制;2、质粒的复制类型;3、质粒的不相容性;在大肠杆菌中的质粒，可以分为：;除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;大肠杆菌接合（conjunction）;2. 非接合型质粒：;克隆载体体外重组DNA实验中克隆载体克隆载体;带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。;（1）分子量小：;（4）质粒的空间构型：;③ 线形DNA （ linear ，lDNA）;（5）质粒空间构型与电泳速率;二、标记基因 (marker gene);氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）; 常用抗菌素的抗性工作原理;② 四???素（Tetracycline，Tet）;③ 氯霉素（chloramphenicol，Cml）;④ 卡那霉素（kanamycin，Kan）;⑤ 链霉素（Streptomycin，Str）;克隆载体体外重组DNA实验中克隆载体克隆载体;;（2） 遗传标记基因;克隆载体体外重组DNA实验中克隆载体克隆载体;Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。;?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。;3）lacZ的?肽互补;受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失?肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解X-gal ;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解X-gal。产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;4） IPTG的诱导作用;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;无质粒的 受体菌;② 插入失活（insertational inactivation）;;（1）分子量大，拷贝数低;克隆载体体外重组DNA实验中克隆载体克隆载体;ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑” ）。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞…….;（1） 具有复制起点（ORI）;（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。;第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 ;质粒载体的命名;3、人工构建的质粒载体的类型;（2）低拷贝数的质粒载体;（3）正选择的质粒载体;（4） 克隆型质粒载体;（5） 表达型质粒载体;复制起始点Ori、 选择标记、 多克隆位点MCS;克隆载体体外重组DNA实验中克隆载体克隆载体;（6） 穿梭质粒载体;Yeast复制起点;③穿梭载体的优点;四、经典的大肠杆菌质粒载体;6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。;;2. ColE1;① colicin E1基因的结构;EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。;;pSP2124质粒的Ampr基因;;;（5）pBR322的优点;外源基因?BamH I;氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy;保留了转移蛋白（mob）的作用位点。;① 删除mob识别位点;pBR325：;4. pUC系列;① 复制起点;（2）长度;pUC18/19;;多克隆位点排列方向相反;;（5）pUC系列载体的优点;pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。;pUC118、pUC119;5. pGEM-3Z/4Z;① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在体外就可以转录mRNA;6. 多功能质粒载体 pBluescript II KS（±）;五、质粒载体的不稳定性;有主动分配和随机分配两种假说。;人工构建的质粒载