第八章病毒感染的分子生物学检验.ppt

第八章病毒感染的分子生物学检验;感染性疾病是由特定病原体感染机体后所产生的一类疾病。病原体包括病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生虫等。可采用微生物学、生物化学、免疫学和血液学的方法对这些病原体进行检测，但是这些方法受灵敏度和特异性的限制，在明确病因、潜在感染、早期诊断以及对病原体进行分类、分型鉴定等方面还存在着较大的缺陷。 随着分子生物学的突破性发展以及相关技术的进步，优于传统诊断方法的分子诊断技术在疾病早期诊断、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势，并被广泛应用于病原生物感染性疾病的检测中。;第一节 病毒感染的分子生物学检验策略;一、病毒感染的一般性检出策略;二、病毒感染的完整性检出策略;第二节? 乙型肝炎病毒的分子生物学检测;;HBV感染者的可能转归;一、乙型肝炎病毒的基因组结构特征;HBV DNA是带有单链区的环状双链DNA分子，是已知可感染人类最小的DNA病毒。 基因组长为，相对分子量为(1.6~2.0)ⅹ106。HBV的两条链长度不等。长链为负链L(-)：长度固定，携带有病毒全部的编码 信息。为模板编码病毒蛋白； 短链为正链S(+)：在不同的 分子中长度不等，约负链的 50%～100%。 ;端有一段短RNA，它们是引导DNA 合成的引物。两条链的5 ’ 端以250-300对碱基互补结合 ，所以也称黏性末端，是DNA保持双链环状的基础，也是HBV最常整合到肝细胞染色体中的DNA。;在黏性末端的两侧还各有11个核苷酸 (5’-TCACCTCTGC-3’)构成的顺向重 复序列(DR)，DR1位于 长链的5 ’端，DR2位于 短链的5’端，中间相 隔223个核苷酸，DR是 DNA成环及病毒复制的 关键区域。;HBV DNA为了能在细胞内独立复制，充分利用其遗传物质，其编码区有广泛的重叠，以扩允其编码容量。 多个ORF 可读码2次以上，编码2个以上蛋白质。;2、C基因区 C基因区分为前C区和C区两部分。 C区由459 个核苷酸组成，编码产物为183 个氨基酸残基组成的多肽序列，称为C蛋白（HBcAg）； 前C区由87个氨基酸残基组成，编码29个氨基酸残基组成的多肽称为前C蛋白。 整个C基因区编码212氨基酸残基组成的多肽称为乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。; ;(二)???型肝炎病毒基因组编码产物;1、外膜蛋白 编码HBV外膜蛋白的基因有三个起始密码子(AUG)，一个终止密码，编码产物有三种。 由于PreS1在不同的亚型中有差异，所以不同亚型外膜大蛋白的肽链长度不等。;②外膜中蛋白 由前S2蛋白和小蛋白组成。前S2基因编码的55个氨基酸通常是亲水性的，具有比S蛋白更强的免疫原性，对前S2蛋白免疫原性的研究可为制备高效价乙肝疫苗提供依据。;2、核心区蛋白 HBV DNA的核心基因区编码HBcAg和HBeAg。;HBcAg抗原性很强，能刺激机体产生抗HBc，但无中和作用，如检出高效价抗HBc，特别是抗HBc-IgM则表示HBV在肝内处于复制状态。 不同亚型的HBcAg长度不等，一般在183~214个氨基酸。 HBcAg相对保守，不同亚型HBcAg的变异率6%。;HBeAg蛋白由前-C基因开始编码（包括前C和C基因），由212个氨基酸残基组成： HBeAg为可溶性蛋白质，游离于血中，可作为HBV复制及具有强感染性的一个指标。 抗-HBe能与受染的肝细胞表面HBeAg结合，通过补体介导破坏受染的肝细胞，有一定的保护作用。抗-HBe的出现是预后良好的征象。 ;前-C区是一个极易发生突变的区域。前-C基因突变后，造成HBeAg的分泌水平下降或完全终止，形成HBeAg阴性的前C区突变株，使受感染的细胞不能被抗-HBe及相应的细胞免疫所识别而清除，从而使变异株在抗-HBe阳性的情况仍大量增殖。因此临床上将慢性乙型病毒感染分为HBeAg 阳性和HBeAg阴性两类患者。对HBeAg阴性抗-HBe阳性的患者应注意监测血中病毒DNA。;3、DNA多聚酶蛋白 HBV DNAP是由P基因区编码的一种依赖于RNA的DNA聚合酶，具有逆转录酶的活性。 HBV DNAP存在HBV的核心中。 HBV DNAP含832~845个氨基酸残基，其一级结构富含组氨酸，是一种碱性蛋白，分子量约90kDa，需要在2阶镁离子存在条件下起作用。 根据HBV DNAP 的基因功能，大体上将其分成4个功能性片段：从HBV DNAP的蛋白质N-端，依次为引物酶区、隔离片区、逆转录酶区和RNaseH区。 HBV DNAP ORF突变可造成HBV复制停止，提示在这一区域进行定点诱变的研究可为HBV治疗提供重要靶区。;4、X蛋白 是由X基因编码的，也称 HBxAg，只存在于哺乳动物嗜肝病毒中。 X蛋白分子量为 ，其功能复杂多