SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告.ppt

实验报告 课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称：SDS测定蛋白质相对分子质量实验类型：生物化学 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的 学习 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。 掌握 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 二、实验原理 ①电泳是指带电颗粒在电场中的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、 核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电 荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电 场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯 度鉴定、分子量测定等。影响带电粒子在电场中泳动的因素有生物大分子的性质，缓冲液的PH 值， 电场强度，电渗和支持介质的筛孔。 电泳常用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青 FF。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、 甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。 ②SDS测定蛋白质相对分子质量 在聚丙烯酰胺凝胶中加入十二烷基硫酸钠（SDS）后，SDS 结合的蛋白质带有一致的负电荷，同 时还引起蛋白质构想的改变。蛋白质-SDS 复合体的流体力学和光学性质表明，其在水溶液中呈现类 似于雪茄烟形状的长椭圆形，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对 分子质量的大小成正比变化，因此电泳时其迁移速率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷 和形状无关。 在本实验中，以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测 样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)。 ③浓缩胶的工作原理 浓缩胶对蛋白样品具有压缩堆积作用。凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上， 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选 pH6.8 的 TRIS/HCL 缓 冲液，电极液选 TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL 解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。 蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开 始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因 而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动 界面附近，浓缩成一中间层。大大提高了电泳的灵敏度。 二、实验步骤 SDS测定蛋白质相对分子质量 安装垂直板型电泳装置 ?干净的小烧杯中按所列的试剂用量配制(所列试剂见表 1) ? 注胶至红线下方，上用蒸馏水覆盖 ?在另一个干净的小烧杯中配置浓缩胶 ( 配方见表 2) ? 待胶凝固后电倒去水层，注入浓缩胶 ?凝固后将电极缓冲溶液倒入上、下贮槽中没过短玻璃片 ? 在样品凹槽内按下列表格加样 ?插入电源开始电泳 ( 开始时 30V ，后为 60V ，电泳 2h) ? 结束后将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内考马斯亮蓝染色 45min ? 染色完毕倾出染色液加入脱色液，20min 换一次脱色液，2 次后初步观察电泳条带 ? 脱色过夜，直至背景清晰?计算相对分子质量 样 1/15μL 品 牛血清白蛋白 /15μL 白 牛血清白蛋白 /15μL 表 2 4.5％浓缩胶胶浓度 5 ml 体积配制用量 30%凝胶贮液 浓缩胶缓冲液 10% SDS ddH2O 10%过硫酸胺 2%TEMED 0.75mL 0.83mL 0.1ml 3.0 mL 0.03mL 0.3mL 样品 2/15μL 蛋 Marker/10μL 表 1 12％分离胶浓度 10ml 体积配制量 30%凝胶贮液 分离胶缓冲液 10% SDS ddH2O 10%过硫酸胺 2%TEMED 4.0ml 1.25ml 0.1ml 4.0ml 0.06ml 0.6 ml 三、实验结果 对脱色过夜后的凝胶进行测量，溴酚蓝迁移距离 95mm 11.1 0.12 130 2.11 18.0 0.19 100 2.00 21.2 0.23 70 1.85 28.0 0.30 55 1.74 38.0 0.40 40 1.60 46.0 0.48 35 1.