悬浮细胞培养技术课件.pdf

精品教学课件设计 | Excellent teaching plan 悬浮细胞传代及细胞计数 一、 细胞传代 实验目的： 掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。 实验原理： 培养细胞生长一定时间后， 需分离再培养， 否则细胞因生存空间不够， 细胞密度 过大，致营养不足而引起细胞衰老、 停止生长甚至死亡。 为了维持细胞的存活和 生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继 续扩大培养。 实验用品： （一）仪器 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（ 4 ℃、 -20 ℃、 -70 ℃）、倒置 相差显微镜、培养箱； （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、 （三）塑料器皿 吸头、枪头、胶塞、移液管、 15ml 离心管、离心管架 （四）其他物品 微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂 1640 培养液、 PBS 操作步骤： 1. 准备： 打开培养液， PBS； 取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸 头，插入离心管备用。 2. 从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。 3. 首先观察培养板孔中培养液量。 用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液， 转入离心管中。再另取一只吸管吸取 PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁， 精品教学课件设计 | Excellent teaching plan 吸出转入离心管。 4. 离心，设置离心机 1000 转/ 分， 4-5 分钟。 5. 取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约 7ML放入离心管， 轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。 6. 吸取 1ML细胞悬液 1ML转入 EP管中，备计数用。 7. 其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约 1ML。 8. 吸取培养液加入板孔中至 1/3 孔容量。 9. 镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。 二 、细胞计数及生长曲线测定 培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 潜伏期 (latent phase) 细胞接种后 , 先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期 . 此时 , 细胞质回缩 , 胞 体呈圆球形 . 然后细胞贴附于载体表面 , 称贴壁 , 悬浮期结束 . 细胞贴壁速度与细 胞种类 , 培养基成分 , 载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞 贴壁速度慢 , 可达 10-24 小时或更多 , 而传代细胞系贴壁速度快 , 通常 10-30 分 钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期 . 原代培 养细胞潜伏期长， 约24-96 小时或更长 , 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短， 仅需 6-24 小时。 (2) 指数增生期 (logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段， 分裂相细胞增多。 指数增生期细胞分裂相数量可作 为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（ Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指 数介于 0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数 可高达 3 ％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期， 也是冻存细胞的最好时机。 在接种细胞数量适宜情况