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精品教学课件设计 | Excellent teaching plan
悬浮细胞传代及细胞计数
一、 细胞传代
实验目的: 掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理:
培养细胞生长一定时间后, 需分离再培养, 否则细胞因生存空间不够, 细胞密度
过大,致营养不足而引起细胞衰老、 停止生长甚至死亡。 为了维持细胞的存活和
生长,必须进行再培养,即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继
续扩大培养。
实验用品:
(一)仪器
净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱( 4 ℃、 -20 ℃、 -70 ℃)、倒置
相差显微镜、培养箱;
(二)玻璃器皿
吸管(弯头、直头)、培养瓶、废液缸、
(三)塑料器皿
吸头、枪头、胶塞、移液管、 15ml 离心管、离心管架
(四)其他物品
微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪
(五)试剂
1640 培养液、 PBS
操作步骤:
1. 准备:
打开培养液, PBS;
取出离心管,拧开管盖,管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管,装上吸
头,插入离心管备用。
2. 从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3. 首先观察培养板孔中培养液量。 用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液,
转入离心管中。再另取一只吸管吸取 PBS,放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,
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吸出转入离心管。
4. 离心,设置离心机 1000 转/ 分, 4-5 分钟。
5. 取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸。吸取培养液约 7ML放入离心管,
轻轻吹打细胞,使之均匀悬浮。
6. 吸取 1ML细胞悬液 1ML转入 EP管中,备计数用。
7. 其余的细胞分别放入六个孔中,每孔约 1ML。
8. 吸取培养液加入板孔中至 1/3 孔容量。
9. 镜下观察细胞是否分布均匀,放入培养箱培养。
二 、细胞计数及生长曲线测定
培养细胞生长过程:潜伏期→指数增生期→停滞期
潜伏期 (latent phase)
细胞接种后 , 先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期 . 此时 , 细胞质回缩 , 胞
体呈圆球形 . 然后细胞贴附于载体表面 , 称贴壁 , 悬浮期结束 . 细胞贴壁速度与细
胞种类 , 培养基成分 , 载体的理化性质等密切相关。一般情况下,原代培养细胞
贴壁速度慢 , 可达 10-24 小时或更多 , 而传代细胞系贴壁速度快 , 通常 10-30 分
钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期 . 原代培
养细胞潜伏期长, 约24-96 小时或更长 , 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短, 仅需
6-24 小时。
(2) 指数增生期 (logarithmic growth phase)
这是细胞增殖最旺盛的阶段, 分裂相细胞增多。 指数增生期细胞分裂相数量可作
为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数( Mitotic
index, MI)表示,即细胞群中每 1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指
数介于 0.1%-0.5%,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数
可高达 3 %-5%。指数增生期的细胞活力最好时期,是进行各种实验最佳时期,
也是冻存细胞的最好时机。 在接种细胞数量适宜情况
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