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PCR原理及注意事项 PCR一、PCR的原理PCR，Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反响，由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间创造。该技术根本原理如下：在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下，依靠于DNA polymerase的酶促合成反响。DNA polymerase以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成局部双链。在适合的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端(退火),并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延长，合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环。1.PCR反响的根本成分包括：Templates DNA(待扩增DNA)、Primers、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适合的Buffer(对于高GC含量的模板有时参加3% DMSO)。类似于DNA的自然?复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。2.PCR由变性--退火--延长三个根本反响步骤构成：①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响做预备；②.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃或60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③.引物的延长：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链，新链又可成为下次循环的模板。3.PCR的反响动力学PCR的三个反响步骤反复进展，使DNA扩增量呈指数上升。反响最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示实际扩增效率，平均约为75%，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反响中平均效率达不到理论值。假如进展30个Cycles，实际扩增倍数往往为106-107〔理论上以Y=2n计算，为109〕。反响初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的渐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应〞，这种效应称平台期。PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有关。大多数状况下，平台期的产生不行避开。二、PCR的种类1.常规PCR2.反转录PCR〔reverse transcription，RT- PCR〕先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板，Primer 1〔常用Oligo(dT)引物〕为引物合成与其互补的cDNA〔complementary DNA〕，再以cDNA为模板，Primer 2为引物进展PCR 反响。常用逆转录酶有AMV〔avian myeloblastosis virus，酶活最适温度42℃〕和MMLV 〔moloney murine leukemia virus，酶活最适温度37℃〕。RT-PCR是一种快速简便敏感度极高的检测mRNA转录量或蛋白表达程度的方法。半定量RT-PCR以组织中普遍表达且表达量恒定的管家基因的mRNA表达为对比，将目的基因mRNA 与之一起逆转录成各自cDNA，最终计算它们的比值来到达对mRNA表达半定量的目的。3.实时荧光定量PCR〔Quantitative Real-time PCR，Q-RT-PCR〕在PCR反响体系中参加荧光基团〔SYBP Green 1或Taqman或分子信标等〕，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最终通过标准曲线对未知模板进展定量分析的方法。利用荧光信号的改变实时检测PCR扩增反响中每一个循环扩增产物量的改变，通过Ct值〔C 代表Cycle，T代表threshold〕和标准曲线的分析对起始模板进展定量分析。Ct值：扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时所经过的扩增循环次数。荧光阈值是前3-15个循环荧光信号的标准偏向的10倍。用处：肯定定量检测起始模板数的准确拷贝数，通常用到标准曲线；相对定量确定经过不同处理的样本目的转录本之间或不同基因之间的基因表达差异；基因型/等位基因分析，例如SNP检测；转基因生物监测等4.重组PCR〔又称重叠PCR，overlap PCR〕：制备杂合基因5.多重PCR(又称复合PCR，multiplex PCR)两对或两对以上引物在一个反响体系中扩增多条目的基因片段6.不对称PCR：用法浓度相差100倍