实验二、福林酚试剂法测定测定蛋白质的含量.pptVIP

实验二、Folin—酚法测定蛋白质的含量 一、原理 可溶性蛋白与Folin—酚试剂反应， Folin—酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色复合物，蓝色的深浅与蛋白质的含量呈正比。因为蛋白质中含有酚基的氨基酸。根据蓝色深浅测定消光值即可求出可溶性蛋白质的含量。 这两种显色反应产生深兰色的原因是： ?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 ?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 五种蛋白质测定方法比较如下： ? 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ?2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低 1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50～100?g 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶； 各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高 ～5?g 慢速 40～60 分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时； 颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1～5?g 快速 5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其?max由465nm变为595nm 强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS 最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 此法可检测的最低蛋白质量达5?g。通常测定范围是20~250?g 二、材料和试剂 1、标准蛋白质 250ug/ml 牛血清白蛋白溶 于重蒸水溶液 2、Folin—酚试剂甲 A0.2MNaOH+4%NaCO3 等体积混合 配100ml B2%酒石酸钾钠+1%CuSO4.5H2O 等体积混合 配10 ml 当天使用时混合有效A 100ml+B 2ml 3、 Folin—酚试剂乙 吸取5ml苯酚+5mlMNaOH滴定至酸浓度为1M 附：乙试剂配制方法： 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。 4、 分光光度计 5、恒温水浴锅 6、蛋白质样品溶液 A：鸡蛋清白蛋白 100-250ug/ml 的重蒸水 B：土豆 取样品用水冲洗干净，用纱布擦干，立即称取1-5g鲜样，置研钵中加重蒸水少许及石英沙，研磨成匀浆，过滤弃去残渣，定容至50 ml,滤液经6000 r/min离心30分钟，取上清液待测。 五、 操作 1、标准曲线制作： ml标准蛋白液于带塞小试管，分别加入不同量的蒸馏水到1ml ，各加5ml ml试剂乙，立即混匀，25℃左右反应30分钟，于500nm波长下测定消光值，以OD500为纵坐标，含量为横坐标，绘出标准曲线，（浓度低时可用OD750nm） 2、样品测定 ml样品液加5ml ml试剂乙，立即混匀，25℃左右反应30分钟，于OD500nm波长下测定消光值，从标准曲线上查出蛋白质的浓度。 注意： 1、因Folin—酚试剂反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后