q-PCR实验原理、过程、数据处理及应用.docxVIP

q-PCR（Quantization Polymerase Chain Reaction）聚合酶链式反应 一、名称辨析 PCR 即常规的聚合酶链式反应。以DNA为模板，体外高温条件（95℃）使其解聚成单链；随后于低温状态（60℃）实现单链NA与引物的互补配对；之后在DNA聚合酶-Taq酶的最适温度（72℃）下，利用dNTP实现互补链的合成，形成子代的双链DNA分子。重复该过程，实现目标基因的扩增。在扩增过程中，对于目标基因的特异性选择是由引物承担的。 q-PCR 又称Real-Time PCR、q-real time PCR，均指的是定量PCR。其实质是在常规PCR的基础上，向反应体系中加入荧光基团（实验室所用的是SYBR GreenⅠ，该荧光基团在游离状态下几乎不产生荧光信号，但在和DNA双链中的小沟结合后，其荧光信号会呈几何倍数地上调），并在PCR扩增过程中对于体系荧光信号出现的顺序和强弱进行连续检测，通过荧光信号和DNA双链含量之间的定量关系，实现对于初始模板中目的基因拷贝数的定量分析。 RT-PCR 即Reverse Transcription PCR（逆转录PCR）。以RNA为模板，逆转录生成单链cDNA（第一链cDNA），之后以该cDNA为模板进行扩增。RT-PCR通常和q-PCR合成为q-RT-PCR，即以RNA逆转录后扩增的到的足量cDNA进行的q-PCR定量分析。 补充：q-RT-PCR的分类 一步法（One-Step q-RT-PCR） 两步法（Two-Step q-RT-PCR） One Step q-RT-PCR反应的反转录反应引物只能使基因的特异性PCR下游引|物，而不能使用 Random primer或 Oligo dt Primer共用引物。 该法反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行，操作简单，污染几率低。但此时的反转录反应和PCR反应都并非为各自的最适条件，所以 One Step RT-PCR通常比 Two Step RT-PCR反应效率低。 RNA病毒检测等以基因检测为目的q-RT-PCR反应，应优先考虑防止污染，所以最好选择一步法。 Two-Step q-RT-PCR可选择 Random Primer 、Oligo dt Primer或基因的特异性引物进行反转录反应。使用反转录引物时可以根据实验目的选择最合适的反转录引物，如果选择 Random Primer或 Oligo dtPrimer，合成的cDNA可用于复数种类基因的检测。 该法中逆转录所得的cDNA溶液可以-20℃长期保存，供以后解析使用。在第二步反应时，将一部分反转录反应液(cDNA)作为模板添加到 Real TimePCR反应液中。 基因表达解析等绝大部分RT-PCR，最适合选择 Two Step RT-PCR反应。 二、实验原理 1、仪器工作原理 PCR控温系统 主要有温度调节及监控系统，保证仪器能按照设定的PCR反应程序进行升温、恒温、降温。 荧光监测系统 主要有激发光发射源、信息采集系统以及信号处理系统。在退火阶段，激发光作用于样品中的荧光基团（SYBR GreenⅠ）后使之产生荧光，之后由荧光采集系统进行荧光信号的接收，并并对荧光信号进行简单处理转化为电信号。 数据收集分析系统 根据荧光检测系统提供的信息对于整个PCR过程进行扩增曲线和溶解曲线的绘制，并基于此进行其他分析。 2、定量基础 现在q-PCR主要有两种方法实现荧光定量的目的，即荧光探针法（Taqman Probe）和荧光嵌合法（SYBR GreenⅠ）。 荧光探针法（Taqman Probe） 荧光嵌合法（SYBR GreenⅠ） Taqman 探针本质是一种寡核苷酸，其只能与目标模板进行特异性配对。该探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团。在探针完整状态下，5`端的荧光信号被3`端的淬灭基团所吸收。进入PCR循环后，每一次扩增中每一个分子引物结合到模板上时都会有一分子探针结合于也结合其上。而DNA聚合酶-Taq在实现dNTP和模板结合的同时，会发挥其内气酶活性对探针进行切割，使5`端的荧光基团游离，从而产生荧光信号。 SYBR-GreenⅠ在游离状态下无荧光信号，但是其能和DNA双链的小沟实现可逆性地结合，从而对模板的合成量进行标识。 也是由于其可逆性结合的特性，在完成整个PCR过程后，可逐步升温使所得的DNA双链全部解聚，便能够得到一条荧光强度-温度的变化曲线，并基于此对扩增的特异性进行分析。 三、引物订购——详情查看 （引物订购教程） 四、PCR过程 PCR主要由两部分组成，即cDNA的扩增以及产物的溶解，前者对应扩增曲线，后者对应溶解曲线，两者均是荧光强度-扩增循环数曲线图。 扩增曲线 溶解曲线 即描述PCR扩增过程的曲线，