Western-Blot常见问题解析.docxVIP

Western-Blot常见问题解析 Western-Blot常见问题解析 PAGE Western-Blot常见问题解析 Western Blot常见问题解析 问题 可能原因 解决方法 凝胶未聚合。 单体纯度不够。 更换试剂。 凝胶溶液中，有溶解氧，抑制了凝胶聚合。 使用抽气泵抽出空气。 过硫酸铵实效或量不够。 应新鲜配制或换其他批号的过硫酸铵或增加溶液。 加入水层时凝胶已聚合。 聚合速度过快。 1.加催化剂之前，冷却凝胶溶液，让聚合速度减慢； 2.减少TEMED或过硫酸胺用量； 3.加快操作。 “微笑”(smiles)现象：即指示剂前沿呈现两边向上的曲线形。 凝胶冷却不均匀，中间部分冷却不好，致使凝胶中的分子有不同的迁移率。 更换凝胶。 “皱眉”(frowns)现象：即指示剂前沿呈现两边向下的曲线形。 常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。 更换凝胶 由于拔梳子时产生负压的缘故，造成浓缩胶和分离胶交界处分离，且加样孔底部开裂。 灌胶时梳子一定要是干燥的！梳子不要拔太快，可略左右晃动。 电泳时间比正常要长。 凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误，及缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小或缓冲系统的离子强度太高。 更换缓冲液 沿指示剂向相反方向移动。 电源连接的正、负极错置或缓冲液选择错误。 检查电源连接的正、负极是否正确； 或更换缓冲液。 Western blot结果中背景高且不均匀。 使用的封闭液不兼容。 更换一种不同的封闭液。 膜封闭不够，非特异性位点封闭不足。 1、选择更加适合的封闭液； 2、提高封闭液中蛋白的浓度； 3、优化封闭时间和/或温度； 4、室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜。 抗体浓度太高。 一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度。 一抗孵育的温度偏高。 4℃孵育过夜。 抗体孵育不均匀。 在孵育过程中始终进行震荡。 洗涤不充分。 增加洗涤次数和使用缓冲液的体积。 缓冲液污染或结块沉淀。 制备新的缓冲液；缓冲液使用前过滤。 操作设备被污染。 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物；保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景。 膜的曝光时间过久。 缩短印迹膜曝光的时间。 膜在实验过程中干过。 保证膜完全被液体覆盖，保证膜始终是湿润的，避免其干燥。 膜破损或污染。 小心夹膜：损坏膜可能导致非特异性结合；不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子。 选择的膜容易产生高背景。 一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。 Western blot结果中杂带较多。 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。 查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。 目的蛋白有其它剪切本。 查阅文献或生物信息学分析可能性。 样本处理过程中目的蛋白发生降解。 加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 上样量过高，太敏感。 适当减少上样量。 一抗或者二抗浓度偏高。 降低抗体浓度。 一抗特异性不高。 重新选择高特异性的抗体。 Western blot结果中信号弱或无信号。 蛋白未完全结合到膜上。 1.确保转膜过程中胶与膜完全接触； 2.确保转膜夹层排布正确； 3.确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜； 4.确保转膜过程未过热； 5.优化转膜时间和电流； 6.在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合； 7.低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。 抗体不足。 增加抗体浓度；抗体可能失活。 抗体浓度太高。 使用太多一抗或二抗可能导致信号迅速消失，呈现出很弱的信号。 抗原不足。 1.加入更多的蛋白进行跑胶； 2.抗原被封闭液掩蔽； 3.试用不同的封闭液； 4.优化封闭液中蛋白浓度。 缓冲液中含有叠氮钠。 叠氮钠是一种HRP的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。 曝光时间太短。 延长曝光时间。 底物孵育时间太短。 进行5分钟的底物孵育。 底物失活。 重新加入底物；确保两种底物无交叉污染，两种底物试剂的污染可能导致活性下降。 膜可以修复剥离重新检测。 在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性，优化剥离程序；避免在同一张膜上重复进行检测。 在膜上消解抗原，封闭底物可能含有蛋白水解酶活性。 准备一张新的印迹膜。 印迹膜保存时蛋白降解。 准备一张新的印迹膜。 检测样本不表达目的蛋白。 选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。 检测样本低表达目的蛋白。 提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 抗体不能识别测试种属的相关蛋白。 确定抗体是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白 一抗孵育时间不足。 建议4℃孵育过夜。 二抗与一抗不匹配。 选