分子杂交技术.pdf

. 分子杂交技术 分子杂交技术 互补的核苷酸序列通过 Walson-Crick 碱基配对形成稳定的杂合双链分子 DNA 分子的过程称为杂交。 杂交过程是高度特 异性的 ,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。 杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组 DNA, 也可以是细胞总 DNA 或总 RNA 。 根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的， 也可以在细胞内杂交 , 即细胞原位杂交。 探针必须经过标记， 以便示踪和检测。 使用最普遍的探针标记物是同位素 , 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性 , 因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶 切图谱的制作、 基因组中特定基因序列的定性、 定量检测和疾病的诊断等方面。 因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地 应用 ,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。 第一节 核酸探针标记的方法 核酸探针根据核酸的性质， 可分为 DNA 和 RNA 探针 ;根据是否使用放射性标记物的与否 ,可分为放射性标记探针和非放 射性标记探针 ;根据是否存在互补链 ,可分为单链和双链探针 ;根据放射性标记物掺入情况 ,可分为均匀标记和末端标记探针。 下面将介绍各种类型的探针及标记方法。 一、双链 DNA 探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链 DNA 探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。 双链 DNA 探针的合成方法主要有下列两种 :切口平移法和随机引物合成法。 1. 切口平移法 (nick translation) 当双链 DNA 分子的一条链上产生切口时 ,E.coli DNA 聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口 的 3 羟基末端。同时该酶具有从 5 →3的核酸外切酶活性 ,能从切口的 5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的 3端补上核苷酸 ,从而使切口沿着 DNA 链移动 ,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸， 将放射性同位素掺入到合成新链 中。最合适的切口平移片段一般为 50-500 个核苷酸。 切口平移反应受几种因素的影响 : (a) 产物的比活性取决于 [ α-32 P]dNTP 的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。 (b) DNA 酶Ⅰ的用量和 E.coli DNA 聚合酶的质量会影响产物片段的大小。 (c) DNA 模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性 , 故应使用仔细纯化后的 DNA 。 材料： 待标记的 DNA 。 设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。 试剂： (1)10 ×切口平移缓冲液 :0.5mol/L Tris ·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100 μg/ml BSA。 (2)未标记的 dNTP 原液 : 除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外 ,其余 3 种分别溶解于 50mmol/L Tris Cl (pH7.5)· 溶液中 ,浓度 为 0.3mmol/L 。 (3)[ α-32 P] dCTP 或[ α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10 μCi/ 。μl