蛋白质含量测定方法.pdfVIP

实验七 蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲 (Biuret) 法，酚试剂法 (Lowry) 法及紫外吸收法。 [ 目的要求 ] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2 ．了解染料法、双缩脲法、 Lowry 法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [ 实验原理 ] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝 G-250 颜色从红 色变为蓝色，吸收高峰从 460nm移至 595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的 Lowry 法趋势， 因为它操作简单， 反应时间短， 染料 - 蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差 异的蛋白质， 有一定误差， 因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的， 故该法适合测定与标 准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [ 器材 ] 吸量管； 试管； 721 型分光光度计 [ 试剂 ] 1. 标准牛血清白蛋白溶液：配成 ml 的溶液。 2. 待测蛋白质溶液。 3. 染料溶液：称取考马斯亮蓝 G-250 溶于 95%的酒精 50ml ，再加入 85%的浓磷酸 100ml ， 用水稀释至 1000ml, 混匀备用。 [ 操作步骤 ] 1．标准曲线的绘制： 试剂 管号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白溶液 0 H2 O 0 染料溶液 A595nm 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀， 5min 后在 595nm 波长处以 0 号管 调零 , 测定各管吸光度值（ A）。以吸光度值为纵坐标 , 蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2 ．样品测定： 取 1ml 样品溶液（约含 25～250 微克蛋白质），加入染料溶液 5ml 混匀， 5min 后测定 其 595nm 吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲 (Biuret) 法测定蛋白质含量 [ 实验原理 ] 在碱性溶液中，双缩脲 (H N-CO-NH-CO-NH) 与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这 2 2 一反应称双缩脲反应。 凡分子中含二个或二个以上酰胺基 ( — CO-NH) ，或与此相似的基团 [ 如 2 —CH2-NH2 ，— CS-NH2 ，—C(NH)NH2] 的任何化合物， 无论这类基团直接相连还是通过一个碳或 氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键 ( — CO-NH—) ，可发生双缩 脲反应， 且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比， 可用比色法测定 蛋白含量。测定范围为 1～10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、 Tris 缓冲 液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近， 以及干扰物质少。 主要的缺 点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定