激光扫描共聚焦显镜.pptVIP

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM);产地：德国 型号：Leica激光扫描共聚焦显微镜 TCS SP5 ;一、LSCM的发展历程 二、LSCM的基本结构 三、LSCM的工作原理 四、LSCM的基本功能 五、LSCM 的优越性 六、LSCM在医学及生物学研究中的应用 七、激光扫描共聚焦显微镜技术教学实验 ;一、LSCM的发展简史 激光扫描共聚焦显微镜是目前生物学领域应用最广泛和图像分辨率最高的实验仪器，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，已成为形态学、分子细胞生物学、材料科学等诸多领域中有力的研究工具。;1957年，Malwin Minsky在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理。 10年后，Egger第一次成功地用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面，所用的共聚焦显微镜的核心是尼普科夫盘(Nipkon disks)，此盘位于光源和针孔之后，从盘射出的光束以连续的光点在盘旋转时照射到物体上，但该技术当时尚不完善。 1970 年，Sheppard 和Wilson推荐了一种新型的激光扫描共聚焦显微镜，同时首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1978年，Brankenhoff发明了高数值孔径的透镜。 1979年，Koester设计了一种共聚焦扫描狭缝器并获得美国专利。1985年，Wijanedts第一次成功地用激光扫描共聚焦显微镜演示了用荧光探针标记的生物材料的光学横断面。 至此，激光扫描共聚焦显微镜技术已基本发展到了一个较为成熟的阶段。 ;二、LSCM的基本结构;三、LSCM的工作原理;图 显示 LSCM的结构示意图;四、LSCM的基本功能 ;五、 LSCM 的优越性 1、动态连续扫描及三维图像重组 LSCM可以对对活细胞和组织或细胞切片样品的不同层面进行连续逐层扫描, 来获得各个层面的图像，即所谓的“无损伤的光学切片”。LSCM扫描的每个层面之间的间距可以达到0.1um甚至更小。获得的图像通过计算机重组，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像，与普通光学显微镜获得的图像相比，LSCM所得的重组三维图像清晰度高、立体感强, 可通过计算机软件对细胞内所研究的结构进行各种测量，对细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的定位方面的研究中有广泛的应用。 2、同时多种物质标记 利用LSCM，通过对膜上、胞浆内多种物质的荧光标记，可以实现在同一样品上同时进行多重物质的观察，比如检测细胞内钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。 ;3、瞬时分辨率高 LSCM的另一大优点是瞬时分辨率高，可以实时动态观察活体组织标本。LSCM 的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光，即其时间分辨率极高，能对细胞内的分子进行功能性动态观察。LSCM技术可对活细胞在无损伤处理的情况下进行观察，跟踪活细胞内的物质或结构和生理过程随时间变化的情况，得到实时动态的连续图像。同时，LSCM的检测灵敏性极强，还可对荧光进行精确定量分析。 4、高质量数字图像 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。LSCM以激光为光源，激光具有单色性强、方向性好、高亮度﹑相干性好等优点，可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。由于LSCM的样品焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样就避免了传统光学显微镜由于光散射造成的图像信噪比降低，图像清晰度和分辨率不高的缺点。而且，LSCM的图像是以电信号的形式记录下来的，可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行各种图像处理。 ;五、LSCM在医学及生物学研究中的应用;3、动态观察 在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用LSCM观察心肌或平滑肌细胞内游离钙、钠、钾离子浓度或pH的动态变化。 4、数据、图像的数字化 用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理。 5、定量测量 首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。 ;肿瘤研究中的应用????1. 细胞生物学：细胞凋亡、细胞三维结构