化妆品用化学原料荧光素渗漏试验.docVIP

化妆品用化学原料体外荧光素渗漏试验方法 Fluorescein Leakage In Vitro Test Method （征求意见稿） 1 范围 本方法规定了化妆品用化学原料体外荧光素渗漏试验方法的范围、试验目的、术语和定 义、试验原理、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。 本方法适用于化妆品用水溶性化学原料眼刺激/腐蚀性的检测。 2 试验目的 预测和评价化妆品用水溶性化学原料对眼睛是否具有刺激作用或腐蚀作用。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本方法。 3.1 眼睛刺激性 eye irritation 眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。 3.2 眼睛腐蚀性 eye corrosion 眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。 3.3 荧光素渗漏率 fluorescein leakage 荧光素渗漏率（FL）是指暴露于受试物后的MDCK细胞模型，一定时间内（30min）对 荧光素钠溶液的渗漏率。试验以不加细胞的嵌入型细胞培养皿（transwell）对荧光素钠溶液 的渗漏率作为最大荧光素渗漏率；以阴性对照组MDCK细胞模型对荧光素钠溶液的渗漏率作 为最小渗漏率（0%渗漏率）。 以受试物引起20%荧光素钠溶液渗漏率时的浓度FL （mg/mL）作为判定受试物眼刺激 20 /腐蚀性的标准。 4 试验原理 以在嵌入型细胞培养皿（transwell）内单层培养的致密犬肾细胞（MDCK）来模拟眼角 膜上皮细胞的屏障结构，通过检测暴露于受试物后的MDCK细胞模型对荧光素钠的渗漏率， 来判断MDCK细胞模型的屏障破坏程度，进而预测和评估受试物的眼刺激/腐蚀性。 5 试验材料与试剂 1 5.1 细胞株 采用犬肾细胞MDCK，该细胞为贴壁生长。要求：来源清晰，代数明确（30代）。 5.2 培养基 本方法采用不含酚红的DMEM-F12（1：1）混合培养液，培养液加入10%胎牛血清（FBS） 和适量抗生素（终浓度为青霉素50～100IU/mL，链霉素50～100μg/mL）。 5.3 溶液的配制 0.01%（w/v）荧光素钠溶液：称取50mg荧光素钠，溶解于500mL不含酚红的HBSS溶液 中，室温避光保存。 100mg/mL 月桂醇聚氧乙烯醚（Brij-35，CAS 9002-92-0）溶液：称取100mg Brij-35， 溶解于1mL不含酚红的HBSS溶液中，可以37℃水浴或超声10min以内的方式助溶。 5.4 溶剂的选择 本方法溶剂为不含酚红的HBSS缓冲液，受试物应在HBSS中以≥250mg/mL的浓度溶解 （至少满足一个剂量≥100mg/mL）；若受试物在HBSS中的溶解度100mg/mL，且测出 FL 100mg/mL时，试验条件仍成立。当受试物无法满足上述溶解条件时，不适用于本方法。 20 5.5 受试物的浓度选择及配制 受试物浓度梯度首选1、25、100、250mg/mL、原液或饱和溶液五个浓度作为浓度梯度 进行检测，若受试物为固体，最高浓度首选750mg/mL。如果细胞毒性出现在浓度 25~100mg/mL之间，则需要追加浓度梯度为：1、25、50、75、100mg/mL的测试；如果细胞 毒性低于1mg/mL，则需追加浓度梯度为：0.01、0.1、0.25、1、10mg/mL的测试。受试物应 在染毒前30min内新鲜配制，否则必须证实储存不影响其稳定性。可采用升温或超声助溶， 超声时间为10min以内，如升温助溶，需注意室温下所有浓度的受试物溶液需保持溶液或混 悬液状态。 5.6 对照的选择 实验应同时设空白对照、阴性对照和阳性对照。以不种细胞的transwell模型加溶剂（不 含酚红的HBSS或矿物油）作为空白对照；MDCK细胞模型以溶剂（不含酚红的HBSS或矿物 油）作为阴性对照，以100mg/mL Brij-35溶液作为阳性对照。 6 试验步骤 6.1 细胞建模 6.1.1 细胞复苏 6.1.2 接种细胞于含10%胎牛血清且不含酚红的DMEM-F12（1：1）混合培养液中，每 2 天观察细胞生长状态，稳定传2代后准备建模。 6.1.3 用胰酶-EDTA（0.05% w/v胰酶，0.02% w/v EDTA）消化细胞，收集细胞于离心 管中，800～1000rmp/min离心5min，重新悬浮细胞于培养液中，调整细胞浓度为4×105/mL。 6.1.4 取无菌24孔板每孔加入400μl 新鲜培养基，将嵌入型细胞培养皿transwell（嵌入型 细胞培养皿厚度为80-150μm，孔径约0.45μm）放入24孔板中，注意避免气泡。其中21个 transwell内室中加入400μl 细胞悬液（终浓度约1.6×105个/transwell），剩余3个transwell中 加入同体积的培养液。将24孔板放入37℃