L-色氨酸含量和纯度的测定实验指导书.pdfVIP

L-色氨酸含量和纯度的测定 实验指导书 一、 实验目的 1. 了解对二甲氨基苯甲醛与L-色氨酸的反应机理； 2. 了解高效液相色谱分析的基本原理； 3. 掌握L-色氨酸的测定方法。 二、 概述和原理 L-色氨酸的分析方法主要有氨基酸自动分析仪分析法、高效液相色谱分析法、毛细 管电泳法、薄层色谱法和分光光度法等。 本实验主要采用分光光度法进行L-色氨酸含量测定。分光光度法测定L-色氨酸的基 本原理为：在硫酸溶液中，L-色氨酸与对二甲氨基苯甲醛发生缩合反应，生成的希夫碱 对二甲氨基苯甲醛缩色氨酸为蓝色，颜色深度在一定范围内与 L-色氨酸含量成线性关 系，可在分光光度计下定量测定。 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，其系统主要由储液器、泵、进样器、色谱 柱、检测器、记录仪等几部分组成，由于该法具有高效、快速和灵敏等特点，不仅可用 于L-色氨酸含量的测定，还可用于纯度的测定。其工作原理为：储液器中的流动相被高 压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱 （固定相）内，由 于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反 复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组 分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图 谱形式打印出来。 三、 实验试剂及仪器 1. 试剂 浓硫酸；对二甲氨基苯甲醛；亚硝酸钠；L-色氨酸标准品；磷酸二氢钾；冰醋酸； 甲醇（液相纯）；纯净水；乙腈（液相纯）。 2. 仪器 紫外可见分光光度计，Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪。 四、 发酵液中L-色氨酸含量的测定 1. 对二甲氨基苯甲醛溶液（3 g/L ）制备 准确称取0.3 g 对二甲氨基苯甲醛，溶于 100 mL 1:1 浓硫酸中。 2. 亚硝酸钠溶液（2% ）制备 准确称取亚硝酸钠0.2 g 于10 mL 容量瓶中，以蒸馏水定容，新鲜配制。 3. L-色氨酸标准储备液（100 mg/L）制备 准确称取25 mg L-色氨酸标准品，用纯水定容于250 mL 棕色容量瓶中，制得浓度为 100 mg/L 的L-色氨酸标准储备液，于4 ℃冰箱保存备用。 4. L-色氨酸标准曲线的测定 将L-色氨酸标准储备液稀释至20 、40 、60、80、100 mg/L，分别量取1 mL 稀释后 的标准液与9 mL 对二甲氨基苯甲醛溶液混合于试管中，沸水加热2 min ，再加入亚硝酸 钠 1 滴，混匀后，继续加热3 min，冷水冷却，最后以试剂作空白，在600 nm 处测定吸 光值。以浓度为纵坐标，相对应的吸光值为横坐标，制作L-色氨酸标准曲线。 5. 发酵样品的处理 取1 mL 发酵液加入离心管中，10000 rpm 离心5 min，取上清，将上清液稀释100 倍后用于L-色氨酸含量的测定。 6. 发酵样品的测定 在与L-色氨酸标准品相同的检测方法下进行样品测定，所得的吸光值与L-色氨酸标 准曲线比对，确定发酵液中L-色氨酸的含量。 五、 L-色氨酸结晶纯度的测定 1. 流动相的制备 称取1.3265 g NaH PO ·2H O 溶解于850 mL 水，加0.5 mL 乙酸，混匀，再加150 mL 2 4 2 甲醇。过滤，超声。 2. 色谱条件 色谱柱：Sunfire-C18 （4.6×250 mm, Agilent 1200 Series LN MP055203 ）； 流速：1 mL/min； 检测波长：278 nm ； 温度：36 ℃。 3. 标准样品的制备 精密称取25 mg L-色氨酸标准品，用纯水定容于25 mL 棕色容量瓶中，制得浓度为 1 g/L 的L-色氨酸标准储备液，于4 ℃冰箱保存备用。精密移取适量上述标准储备液， 用纯水配制成浓度为 10、20 、40 、60、80、100 mg/L 的L-色氨酸标准品溶液。使用前 须用0.22 μm 一次性针头过滤器过滤。 4. L-色氨酸标准曲线的测定 根据上文所述的色谱条件，将上述不同浓度的L-色氨酸标准液进行HPLC 测定，并 以浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，制作L-色氨酸标准曲线。 5. L-色氨酸结晶样品的处理 准确称取25