6.3.3 annexinV结果分析植物生理学.pdfVIP

6.3.3实验结果分析与注意事项 AnnexinV—FITC/PI双荧光染色进行细胞凋亡检测已应用十几年了，非 常经典。荧光标记好的样品，既可以采用荧光显微镜直接观察，也可以采用 流式细胞仪定量分析 （出镜）。 荧光显微镜观察时，凋亡的细胞可以看到细胞膜上有一圈绿色荧光，而 正常细胞无荧光，这样能清晰地知道细胞凋亡是否发生。但近年来大量文献 表明，一些激活的细胞表面也会出现PS外翻现象，却并不发生凋亡。这意味 着仅AnnexinV标记这单独一个指标已不再能得出细胞凋亡的结论，需要联合 其他指标比如PI一起使用。正常细胞膜的通透性不允许PI进入胞内，当细 胞发生凋亡或坏死时，PI就能渗漏进来染上色。那么根据染料的这个特征， 我们可以利用将annexinV,PI这两个指标结合起来一起分析。首先在荧光显 微镜结果图片中，这个双染色的可以确定是凋亡细胞，这个仅有PI染色的是 坏死的细胞，这个仅有ANXV染色的则是凋亡早期。 我们再看流式细胞仪的检测结果，凋亡的细胞体积变小，可以从散点图 上直接判断疑似凋亡的细胞群，这个位置的前向散射光说明细胞体积偏小， 再小就是细胞碎片了，进行下一步分析时需将这些碎片排除在外。剩余的大 部分细胞圈出来进一步进行荧光测定，横坐标为FITC，纵坐标为PI，得到这 样的散点图，采用十字架划分成四个区域， 阴性区对应正常细胞，annexin V-FITC单染区对应早期凋亡，PI单染区对应细胞坏死，双染区对应晚期凋亡。 图上每一个散点都代表一个细胞检测点，这样进行数据统计，我们就可以获 得各个区域里的细胞百分比，通过定量分析比较，评价药物诱导细胞凋亡的 效果。 这个实验关键在于实验样品的制备，我们来看看有哪些注意事项： 1. PI具有毒性及潜在致畸作用，使用时注意防护及避免环境污染； 2. Annexin V和磷脂酰丝氨酸结合依赖钙离子，结合缓冲液中一定要含钙 离子； 避免用PBS(不含钙离子)洗涤细胞，以防止Annexin V-FITC脱色。 3. Annexin V-FITC和PI应避光保存于2～8℃，避免冻融。 4. 收集细胞样品时，包括漂浮在培养基上的细胞一起收集，否则会丢失部 分凋亡细胞，造成误差； 5. 控制细胞浓度，参照说明书使用染色剂剂量，避免细胞过多，染色标记 不充分影响检测结果。 6. 染色样品不宜存放时间过长，1小时内上机检测，否则染色后久放引起 细胞状态变化，造成假阳性。