课件1实验12乳酸脱氢酶同工酶的分离.pptx

第四部分 浅尝现代生物技术;学习目标;乳酸脱氢酶同工酶;乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，分别是 LDH 1、LDH 2、LDH 3、LDH 4、LDH 5。;根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同,pI各不相同,在同一SDS中,在电场中移动速度不同,可用电泳法将其分离。 ;生理及临床意义;聚丙烯酰胺凝胶 ;TEMED催化AP生成硫酸自由基：以AP为催化剂，以TEMED为加速剂。 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： ;Bis将单体长链间连成网状结构：;聚丙烯酰胺凝胶类型：;2.???连续系统: 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式,在电泳分离过程中,由于浓缩胶的堆积作用,可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带,对样品进行浓缩,然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离,既存在电荷效应,也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大,但是它具有连续系统不可比拟的优越性,分辨率高。 不连续电泳的四个不连续性:凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。 ;蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素;分子大小： 蛋白质分子形状和所带电荷和数量相同，分子大小不同 分子形状： 蛋白质所带电荷和数量相同，分子形状不同;乳酸脱氢酶同工酶活性染色;实验内容;1.分离胶制备;2.浓缩胶制备;3.样品处理： 取血清1ml，加入1ml样品缓冲液，混合后供电泳使用。 4.加样： 将凝胶管垂直插入电泳槽上，加样（每管50ul，勿弄破胶面），然后在样品液层上小心地加入电泳缓冲液（勿搅动样品层）。;5.电泳： 凝胶管的上下端分别浸入上下槽缓冲液后，接上电泳，上槽接负极，下槽接正极，开始电泳10分钟内加电流1MA/每管，样品进入分离胶，电流升至2MA/每管，电泳2-4小时，直到溴酚蓝前沿到达距凝胶下端约 0.5 cm时，关闭电源， 停止电泳，取出凝胶管。 ; 6.剥胶： 用带长针头的注射器针筒吸满水，然后将针头沿着玻管壁把水推进并旋转玻管，使胶自由滑出。 7.染色： 将剥出胶柱浸入染色液中，并在37度水浴中保温至酶带显出，大约5-10分钟。;注意事项;1.乳酸脱氢酶能使乳酸发生下列的哪一变化 (　　) A．乳酸脱氢产生丙酮酸 B．使氧化型辅酶NAD＋分解 C．使乳酸氧化生成CO2、H2O D．使乳酸分解成乙醇;解析：本题考查乳酸脱氢酶的作用。根据教材中对其的描述，乳酸脱氢酶(LDH)可以发生以下变化 CH3－CHOH－COOH＋NAD＋ (乳酸)　　　　　(氧化型辅酶NAD＋) CH3－CO－COOH＋NADH＋H＋ (丙酮酸) 所以，正确的答案是A。 答案：A;2.下面对同工酶概念的说法，正确的是 (　　) A．能将不同物质催化反应为同一物质的一组酶 B．能催化同一化学反应，但其酶蛋白分子的组成却不同的一组酶 C．所起的作用都是催化作用的一组酶 D．催化同一个物质生成的物质却不同的一组酶;解析：根据同工酶的概念所述，同工酶是指催化同一化学反应，但其酶蛋白的分子组成却不同的一组酶，所以选项B是正确的。 答案：B;3.下列属于乳酸脱氢酶(LDH)催化得到的物质是(　　) ①乳酸　②NADH　③NAD＋　④H＋　⑤丙酮酸 A．①③　 　 B．②④⑤ C．⑤ 　　D．①;解析：根据下图可知： CH3－CHOH－COOH(乳酸)＋NAD＋LDH(乳酸脱氢酶CH3－CO－COOH(丙酮酸)＋NADH＋H＋　生成物为3个：丙酮酸、NADH、H＋。 答案：B　;4.关于同工酶的叙述，不正确的是(　　) A．LDH各种同工酶的化学本质都是蛋白质 B．LDH共有5种同工酶，分别为H4、H3M、H2M2、HM3、M4 C．LDH是由2种亚基L和M以不同比例组成的四聚体 D．LDH同工酶可用于研究酶的专一性;解析：根据教材中对同工酶概念、特性的描述，D是不正确的。同工酶的用途之一是用以辅助诊断疾病等。 答案：D　;谢谢观看