WB原理流程-优质课件.pptVIP

Western blot 实验技术;定义：;Western Blot基本原理;Western Blot一般流程;通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 0.5ml水+0.5ml裂解液+10μl蛋白酶抑制剂+ 10μl 泛酸钠+ 1μl pepstain 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 ;细胞数量达5×106个时就可以做WB。 将细胞裂解液再离心，收集上清液，加loading煮样5min ;纯净水（ddH2O） 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 （Arc-Bis）。30%（29:1） SDS（10%） Tris-HCL 四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合） 过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基） ;1、我们的市场行为主要的导向因素，第一个是市场需求的导向，第二个是技术进步的导向，第三大导向是竞争对手的行为导向。 2、市场销售中最重要的字就是“问”。 3、现今，每个人都在谈论着创意，坦白讲，我害怕我们会假创意之名犯下一切过失。 4、在购买时，你可以用任何语言；但在销售时，你必须使用购买者的语言。 5、市场营销观念：目标市场，顾客需求，协调市场营销，通过满足消费者需求来创造利润。**** 6、我就像一个厨师，喜欢品尝食物。如果不好吃，我就不要它。***** 7、我总是站在顾客的角度看待即将推出的产品或服务，因为我就是顾客。*** 8、利人为利已的根基，市场营销上老是为自己着想，而不顾及到他人，他人也不会顾及你。**** ;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项：;膜的选择;转膜注意事项（一）;转膜的注意事项（二）;封闭（30min）(封闭时间过短会导致背景过深 );一抗、二抗孵育;显色反应;关于磷酸化蛋白检测的注意事项：;抗体保存注意事项：;Western Blot常见问题分析;SDS电泳;条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？;转膜及抗体检测;背景太高