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布鲁氏菌抗体琼脂凝胶免疫扩散试验 A.1 原理 光滑型布鲁氏菌经三氯乙酸提取获得2种抗原，一种是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），另一种是称为天然半抗原（Native Hapten，NH）的多聚糖。LPS抗原免疫原性强，自然菌和疫苗菌均可刺激机体产生LPS抗体。NH抗原免疫原性弱，自然菌感染尤其在活动期或排菌期持续强烈刺激机体产生NH抗体，而疫苗菌很难产生NH抗体。抗原与血清抗体均可在琼脂凝胶上扩散，结合形成复合物时在琼脂界面出现可见沉淀线。LPS抗原分子量大、扩散慢，沉淀线则靠近抗原端，NH抗原分子量小、扩散快，沉淀线则靠近被检血清端。据此可以鉴别自然感染抗体和疫苗免疫抗体。 A.2 材料 A.2.1 仪器与耗材 恒温恒湿培养箱，10μL~100μL的移液器及吸头。 A.2.2 试剂 布鲁氏菌病抗体琼脂凝胶免疫扩散试剂盒，包含琼脂平板、LPS和NH混合抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。 A.2.3被检血清 牛的新鲜血清。 A.3 操作步骤 A.3.1将试剂盒恢复至室温； A.3.2在琼脂平板的中心孔加入15μL LPS和NH混合抗原（图1“Ag”孔）； A.3.3在琼脂平板周围孔的其中一孔加入15μL阳性对照血清（图1“＋”孔）； A.3.4在琼脂平板周围孔的另一孔加入15μL阴性对照血清（图1“?”孔）； A.3.5在琼脂平板周围孔的剩余孔每孔加入15μL被检血清（图1“1~4”孔）； A.3.6将琼脂平板置于恒温恒湿培养箱，22℃±3℃孵育24h~48h后观察结果。 图1 加样示意图 A.4 结果判定 A.4.1 当“＋”孔与“Ag”孔之间出现两条明显致密的沉淀线（靠近“Ag”孔的沉淀线为LPS抗原抗体复合物，靠近“＋”孔的沉淀线为NH抗原抗体复合物），而“?”孔与“Ag”孔之间无沉淀线时（图2所示）试验成立，否则应重新进行试验。 图2 阳性对照和阴性对照结果示意图 A.4.2 当被检血清孔与“Ag”孔之间出现两条明显致密的沉淀线（如图3中的“2”孔）时，判定该孔血清为布鲁氏菌自然感染抗体阳性；当被检血清孔与“Ag”孔之间仅在靠近“Ag”孔出现一条明显致密的沉淀线（如图3中的“4”孔）时，判定该孔血清为布鲁氏菌疫苗免疫抗体阳性；当被检血清孔与“Ag”孔之间未出现沉淀线时（如图3中的“1”、“3”孔），判定该孔血清为布鲁氏菌病抗体阴性。 图3 不同被检血清结果示意图