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FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中的应用Fluorescence in situ hybridization（FISH） 细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位原理探针变性荧光标记探针杂交样本DNA变性FISH技术的特点操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测FISH探针的种类telomere subtelomereCSP探针：染色体着丝粒探针GLP探针：位点特异性探针 WPP探针：全染色体或染色体区域特异性探针whole chromosome paintcentromerelocusspecific操作流程简图制片 预处理 破坏细胞膜利于探针 杂交。 蛋白酶消化、HCl处理结果分析 FISH 变性 杂交 洗涤 复染FISH技术在乳腺癌检测中的应用乳腺癌 Her-2基因 致癌基因：Her-2基因； 位点：17q11.2-q12； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的扩增； HER-2基因扩增是决定Herceptin治疗是否有效的关键性指标。Her-2基因的检测方法检测方法检测指标优点缺点IHCHer-2蛋白费用低光镜即可观察结果准确性差，主观性强，假阳性率高CISHHer-2 DNA光镜即可观察结果对低度扩增及染色体非整倍扩增检测灵敏度下降FISHHer-2 DNA对于低倍、高倍染色体非整倍性扩增检测准确性高，灵敏度特异性好，结果判断客观相对费用较高Her-2基因FISH 探针组疾病名称检测探针标记颜色探针定位探针名称乳腺癌GLP Her2 / CSP17 红/绿Her2： 17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1 CSP17:17号染色体着丝粒正常: 2红/2绿异常: 红信号大于2为异常细胞(绿色信号不少于2个的细胞)DAPI染色后与HE切片对比图导管内癌观察浸润部分结果判断统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞） Ratio值＝20个细胞核中红信号总数/绿信号总数 Ratio＜1.8 为阴性结果 Ratio＞2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果 比值2～4为低度扩增 4～10为中度扩增 10为高度扩增Ratio在1.8-2.2 之间时，则需要再计数20个细胞核中 的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。 BAHer-2基因扩增状况A. 无须计数的大簇团信号（高度扩增）B. 颗粒状信号（R10，高度扩增）C. 须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）CHer-2基因无扩增情况红信号数2，同时绿信号非整倍体R1.8，无扩增红信号与绿信号均为两点，R=1荧光原位杂交与免疫组化检测Her-2结果比较IHC总数0 1+ 2+ 3+FISH(n=15) (n=5) (n=14) (n=29) （n=63）无扩增 13 3 4 0 20扩增 2 2 10 29 43Her2表达IHC（2+）标本中，基因扩增率为71.41%Her2表达IHC（3+）标本中，基因扩增率为100%（文献报道：90-95%）免疫组化（3+）与FISH对比图 ×100×40×100住院号：177319浸润性导管癌Ⅱ级IHC：+++FISH：呈簇团状高度扩增30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（2+）与FISH对比图 1.×40×100住院号：175465浸润性导管癌Ⅱ级IHC：++FISH：Ratio5，中度扩增30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色免疫组化（2+）与FISH对比图 2.×40×100住院号：176921浸润性导管癌Ⅱ级IHC：++FISH：Ratio＝1.45，无扩增30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色免疫组化（1+）与FISH对比图1×100×4030%的肿瘤细胞弱