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PAGE22 / NUMPAGES \* ARABIC22 测序常见问题及分析 ( 1.PCR产物测序时出现重叠峰。 图1(模板中存在碱基缺失，由于单个位点(1-1)或两个位点(1-2)的碱基缺失，这经常导致测序结果的移码) 图1-1 图1-2 方法:将PCR产物克隆入质粒(如T载体)并测序，或测序前对PCR产物进行PAGE纯化(至少琼脂糖电泳和凝胶切割纯化)。 图2(2(PCR产物不纯，含有两个或多个具有相同部分序列和不同长度的片段) 图2 解决方法:主要原因是PCR产物未经纯化，含有两个以上长度不同的片段，部分片段序列相同。可以通过PCR产物的PAGE纯化(至少琼脂糖电泳和凝胶切割纯化)和测序来解决。 图3(测序引物的碱基缺失) 测序引物有碱基缺失(通常是引物的5’端缺失)，有点类似于模板的碱基缺失，即图1。不同的是，模板的碱基缺失通常导致正常测序序列后的移码，而如果发生引物碱基缺失，移码将从测序开始时发生，并且表面将从一开始就与严重的峰图形重叠。 方法:重新合成引物或通过PAGE纯化引物。 2.克隆和测序过程中出现重叠峰。 原因:选择的重组体不是单克隆的，提供测序的质粒含有两个以上不同插入片段的质粒；或者送去测序的菌液被污染。 方法:重选单克隆菌落(划线分离单菌落)，提取质粒或送菌液再次测序。 3.样品具有杂合/突变位点。 模板存在杂合突变，也就是说模板本身在这个位点有