免疫组化技术简介培训课件.ppt

精品课件资料 常用的方法有： 酶消化法：胃蛋白酶、胰蛋白酶和无花果酶 盐酸水解暴露抗原法：注意温度和时间 微波炉恢复抗原法：微波是一种高频电磁波，可以打开蛋白质之间的交联健，从而使抗原修复。 高压锅恢复抗原法 煮沸恢复抗原法 抗原修复液中的化学成分或离子与部分抗原表位结合产生化学反应，增加了细胞和组织的通透性，便于抗原抗体的充分结合。 * 免疫组化技术简介 * 精品课件资料 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 * 精品课件资料 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 * 精品课件资料 基本概念 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry, IHC)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry, ICC)。 免疫组化 * 精品课件资料 基本概念 抗原（Antigen, Ag） 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。 抗体（Antibody, Ab） 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 * 精品课件资料 基本概念 抗体的结构 V区氨基酸的种类和排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。（抗原特异性，第一抗体） C区氨基酸的组成和排列在同一种属动物Ig同型L链和同一类H链中都比较恒定。 制备第二抗体的重要基础。 一抗：鼠抗人 二抗：羊抗鼠 * 精品课件资料 基本概念 单克隆抗体 由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。 多克隆抗体 由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原决定簇的多种抗体的混合物。 基因工程抗体 在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成后导入受体细胞表达产生的新型抗体。 * 精品课件资料 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 * 精品课件资料 基本原理 抗原 显色 抗体 间接法 直接法 PAP法 LSAB法 * 精品课件资料 基本原理 显色系统 酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物 辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC 碱性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP 酶的选择 HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰 * 精品课件资料 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 * 精品课件资料 操作流程 * 精品课件资料 CONTENTS 目录 01 基本概念 02 基本原理 03 操作流程 04 技术要点 05 结果判读 06 失败原因 07 质量控制 * 精品课件资料 技术要点 免疫原理的选择 一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型） 二抗（属种、标记方法） 显色方式 * 精品课件资料 技术要点 取材 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 (经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细胞有重叠） 各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹水等）。 培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。 取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。 组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。 * 精品课件资料 技术要点 固定 目的：①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。 注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30