第12章基因功能分析的基本策略.pptx

第十二章 基因功能分析的基本策略;第一节 利用转基因模型研究基因的功能;转基因技术概念;一、转基因动物;;转基因动物应用 ;1、不能将外源基因定向地插入受精卵细胞染色体的特定部位； 2、外源基因随机整合可能引起插入突变，破坏宿主基因组功能； 3、外源基因随机整合在宿主染色体上的拷贝数不同，可能出现不同表现型； 4、整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传。 ;二、稳定转染细胞 ;第二节 基因敲除技术;基因敲除技术的基本过程：;③、在目的基因外侧线性化重??载体，并将一个阴性筛选标志基因克隆到此。例如：单纯庖疹病毒（HSV）的胸苷激酶的编码基因为HSV-tk。当它在细胞内合成出胸苷激酶时，可以分解细胞培养液中加入的单核苷酸类似物而产生有毒的分解物使细胞死亡。 这样打靶载体包含了部分待剔除的基因片段、阳性筛选标志基因、阴性筛选标志基因。; 在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时，打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行鉴定。;2、将打靶载体导入小鼠胚胎干细胞中；胚胎干细胞通常取自小鼠胚胎早期的内细胞团，该细胞能在体外培养，并保留发育的全能性。 3、用阳性筛选标志和阴性筛选标志对转染的胚胎干细胞进行筛选。 4、将发生同源重组的胚胎干细胞导入小鼠胚泡中，然后将胚泡植入假孕小鼠子宫中； 5、筛选嵌合体小鼠。通常同源重组一般只发在一条染色体上，可以用Neor基因作探针，通过Southern blot鉴定。 6、杂交育种，获得基因剔除的纯合体小鼠;;;条件性基因敲除、条件性组织特异性基因敲除：; ??? Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。 该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。 ②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。;第三节 利用基因沉默技术对基因功能进行分析;一、反义RNA技术;二、RNA干涉技术;RNA干涉的机制：; RNAi整个过程一般分为3个阶段： 1.长dsRNA分子跨过细胞膜进入细胞内。 2.长dsRNA分子在Dicer酶作用下，被降解成长度为20- 25nt的siRNA分子。 3.siRNA与RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complexes，RISCs）结合并引导RNA诱导沉默复合物 与互补的mRNA分子结合，在RISCs中某些内切核酸酶 的作用下降解mRNA靶分子。;dsRNA;;RNAi研究的一般技术路线;RNA干涉技术的基本过程