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全转录组测序分析:方法、挑战和潜在的解决方案 摘要：全转录组分析在破译基因组结构和功能、识别细胞、生理、生化和生物系统的遗传网络以及建立应对疾病、病原体和环境挑战的分子生物标志物方面发挥着重要作用。在这里，我们回顾了转录组分析方法和技术，这些方法和技术已经被用于进行全转录组散弹测序或全转录组标签/目标测序分析。我们主要研究在测序前如何在mRNA分子的5 和3 端添加适配器/连接子以进行克隆或PCR扩增。文中还讨论了面临的挑战和可能的解决方案。简而言之，下一代测序平台加速了大量基因表达数据的释放。基因组研究界现在是时候集合所有物种的全部转录组，并为每个基因/转录本收集签名靶标，从而在不久的将来利用已知基因/转录本直接确定已知的转录组。 关键词：下一代测序；PolyA+ RNAs；PolyA? RNAs；环状RNAs；RNA甲基化；5′ 端和3′端 前言 全转录组分析旨在捕获编码和非编码RNA，量化细胞、组织、器官甚至整个身体中的基因表达异质性。这项分析也很重要，因为它为先前通过DNA测序[1]揭示的基因/基因组的功能表征和注释提供了第一步; 构建基因相互作用网络的重建蓝图，以了解细胞功能、生长/发育和生物系统[2]; 疾病过程和预后产生的分子指纹可以为药物发现和诊断找到潜在的靶点[3,4]，并为研究宿主和病原体之间的关系提供机会，从而制定新的治疗和预防干预策略[5]。例如，细胞功能、生长和循环通路是导致老年人肌腱衰老相关变性的最重要的基因网络之一，而激活和抑制组蛋白修饰的富集代表了主要的性别二态特征[7]。证据还表明，替代聚腺苷酸化位点的使用偏好具有功能相关性。当分化细胞被用来产生诱导多能干细胞时，例如，全局3UTR(非翻译区域)，缩短事件发生[8]。除了3UTR的广泛缩短外，内含子polyA位点也可在细胞增殖[9]下被显著诱导。同样的情况也适用于T细胞的激活:86%的基因在免疫反应[10]后表达短3UTR亚型。因此，全转录组分析为探索控制农业和人类医学中重要的定性和定量表型的调控途径和遗传网络提供了基础。 毫无疑问，下一代测序(NGS)方法和技术的快速发展，使大规模的全转录组测序项目成为可能。自2005年以来，至少有5个NGS平台主导了市场，包括目前由Life Technologies (Grand Island, NY)拥有的Roche 454 GS FLX(+)系统，Applied Biosystems SOLiD(支持寡核苷酸连接和检测)和Ion Proton/PGM/Chef系统;Illumina公司开发的Solexa GA (Genome Analyzer)/HiSeq/MiSeq/NextSeq;以及太平洋生物科学公司(Menlo Park, CA)研制的PacBio RSII系统[11,12]。这些平台都不依赖于Sanger测序。SOLiD采用连接测序，而其他所有系统采用合成[12]测序。在这5个NGS平台中，只有PacBio系统使用单分子作为测序模板，其他系统则必须进行桥接扩增(Illumina平台)或乳化PCR扩增(Life Technologies的三个平台)，制备相同模板的“簇”进行测序。这些平台的读取长度也相当可变:高达75 bp(配对端)，300 bp(重叠配对端)，400 bp(双向)，700 bp(配对端)和8500 bp，分别由SOLiD, Illumina, Ion Torrent, 454和PacBio系统产生[12]。此外，根据平台[13]的不同，每次运行NGS的读取次数可以从100万到5亿次不等，机器运行时间从8小时到11天不等。 在本综述中，我们将全转录组测序方法和技术分为四类:(1)全转录组霰弹测序(WTSS)，(2)全转录组靶向/标记酶切测序，(3)全转录组靶向/标记酶切测序，(4)其他进展。这些方法和技术依赖于图书馆的准备工作。因此,我们将主要点评:(1)什么是图书馆起始物料,如总RNA, polyA+ RNAs或polyA? RNAs,(2)适配器和连接器都添加到5 和3 端 RNA分子,如通过互补脱氧核糖核酸合成或结扎,(3)如何放大产品排序,如通过克隆或PCR扩增。我们还讨论了与图书馆准备相关的挑战，以及可用于解决这些困难、偏见或挑战的潜在选项或解决方案。简而言之，我们回顾了每种方法的优点和缺点，以便读者在决定什么方法(s)满足他们的研究目标时完全知情。 全转录组霰弹测序 EST(表达序列标签)测序 EST是从随机选择的cDNA文库中获得的单程读取。EST科技文库可以从单个或多个来源的组织、器官或细胞类型制备，以满足各种研究目标。20世纪90年代初开始了相对大规模的EST测序项目。例如，在1991年，Adams和同事[14]报道了600多个来自随机选择的人类大脑cDNA(