DB15T 2593-2022冰草组织培养技术规程.docxVIP

ICS65.020.20CCSB 21 ICS 65.020.20 CCS B 21 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2593—2022 冰草组织培养技术规程 Technical code of practice for tissue culture of agropyron cristatum 2022-06-24 2022-06-24 发布 2022-07-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2593—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古农业大学。本文件主要起草人：徐春波、王勇、赵海霞。 I I DB15/T 2593—2022 冰草组织培养技术规程 范围 本文件规定了冰草组织培养的术语与定义、培养基、外植体、愈伤组织诱导培养、增殖培养、分化培养、生根培养、炼苗与移栽等基本内容及技术要求。 本文件适用于冰草组织培养育苗。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 DB 15/T 1940-2020 西部沙樱组织培养技术规程 术语和定义 NY/T 2306界定的术语和定义适用于本文件。 NY/T 2306界定的术语和定义适用于本文件。 冰 草 agropyron cristatum (L.) gaertn 属于禾本科（Gramineae）冰草属（Agropyron）多年生草本植物。 幼 穗 young ear 生长2至5年、长度1 cm～3 cm的冰草孕穗。 种 子 seed 有生活力、饱满的包含内外稃的冰草种子。 成熟胚 mature embryo 完熟期冰草种子的胚。 4 环境与器具灭菌 1 DB15/T 2593—2022 参照DB15/T 1940执行。 5 培养基 基本培养基 MS培养基、1/2MS、改良MS培养基见附录A。 母液的配制和保存 配制 将常用试剂配制成50～100倍的母液，按照GB/T 603规定方法配制。所用激素均配制浓度为0.5 mg/mL，配制方法详见附录B。 保存 母液配制好分别贴上标签，注明溶液名称、配制倍数、配制日期、配制者。母液贮存在4 ℃的冰箱中。贮藏时间在3个月之内，有霉菌和沉淀产生，则不得使用。 培养基的配制 5.3.1 配 制 蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1 L。 pH 值调节 蔗糖，搅拌溶解后再分别加入母液，搅拌均匀，加蒸馏水定容至1 L。 pH 值调节 用1 mol/L的NaOH将配制好的培养基调到pH值5.8～6.0，用酸度计或精密pH试纸测定。 分装和灭菌 配制好的培养基趁热分装。分装量以占培养容器的1/4～1/3为宜。切勿将培养基沾到瓶口和外壁上， 以免招致杂菌污染。分装后立即加盖，不同的处理做好标记。分装后进行灭菌，121 ℃状态下保持20 min。 6 外植体 外植体选择 幼穗或成熟胚。 外植体制备 幼穗 在超净台上用75%酒精脱脂棉球擦洗叶鞘表面消毒，剥出幼穗，切成0.3 cm～0.5 cm的小段。 成熟胚 2 DB15/T 2593—2022 种子用水浸泡2 h～4 h后，剥去内外稃，置于湿滤纸上吸胀4 h。在超净工作台上75%酒精消毒30 s， 无菌水冲洗至少3次后用0.2%升汞消毒5 min，再用无菌水冲洗数次至少3次。置于铺有湿无菌滤纸的培养皿中，用解剖针从盾片处挑出胚。 7 愈伤组织诱导培养 幼穗 培养基 幼穗愈伤组织诱导培养基为改良MS+2.0 mg/L 2，4-D。 接种 将幼穗段接种在愈伤组织诱导培养基上，每2.5 cm2～3 cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。 培养条件 24 ℃～26 ℃暗培养。 培养时间 培养20 d～30 d。 成熟胚 成熟胚 培养基 成熟胚愈伤组织诱导培养基为MS＋0.2 mol/L甘露醇+ 2.0 mg/L 2，4-D。 接种 将成熟胚接种在愈伤组织诱导培养基上，每1.5 cm2～2 cm2接种1个，均匀摆放，封好皿口，标明名称和日期。 培养条件 见本文件7.1.3。 培养时间 培养14 d～20 d。 8 增殖培养 幼穗 培养基 幼穗增殖培养基为改良MS+2.