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RT-PCR和 Q-PCR 1、 细菌总 RNA反转录（ RT-PCR） 1. 在 冰 上 融 化 RNA模 板 。 在 室 温 (15 - 25 ℃ ) 下 解 冻 gDNAWipeout Buffer,Quantiscript 逆转录酶, Quantiscript RT Buffer, RT Primer Mix, RNase-free water 。将每份溶液震荡混合于管中。离心机短暂离心并收集管中残 余液体, 然后放置于冰上。 2. 根据表 2-2 ，在冰上准备基因组 DNA消除反应。混合。 注意: 如果设置多个反应, 准备一个主要的混合 gDNAWipeout Buffer 和 RNase-free water 体积大于 10%,所需反应的总数。适当分配主要混合液于几个 管, 然后向单管中加入 RNA样本。 注意: 这份成分表适用的 RNA量是 10 pg 至 1 μg。如果使用1 μg的 RNA, 则反应规模成线性增长。例如 , 如果使用 2 μgRNA，则每个成分变成双倍，最后 总体积 成 28 μl 。 表 2-2. 基因组 DNA消除反应成分 Tabel2-2 Genomic DNAelimination reaction components 成分 体积/ 反应 gDNAWipeout Buffer 7× 2 μl 模板的 RNA（最高用量为 1 μg） 适量(5 μl) RNase-free water 适量(7 μl) 总反应体积 14μl * 此数量包含所有 RNA,包括任何 rRNA,信使核糖核酸、 病毒 RNA,和载体 RNA,无论使用的 引物、cDNA分析。 3. 在 42℃孵化 2 分钟, 然后立即放置于冰上。 注意: 不要在 42℃培养超过 10 分钟 4. 根据表 2-2 准备反转录混合液（ the reverse-transcription master mix） 于冰上。混匀, 然后保持在冰上。 反转录混合液包含所有合成第一条 cDNA所需的 成分，但除了模板 RNA。 注意: 如果设置多个反应, 准备主混合 10%的体积大于所需反应的总数。 分配 适当的体积成单个管。 注意: 如果使用1 μg的 RNA,则反应规模成线性增长。例如 , 如果使用 2 μg RNA，则每个成分变成双倍，最后总体积 成 40 μl 。 表 2-3.Reverse-transcripition 反应成分 Tabel2-3. Reverse-transcripition reaction components 成分 体积/ 反应 Reverse-transcription master mix， 1 μl Quantiscript Reverse Transcriptase Quantiscript RT Buffer, 5x 4 μl RT Primer Mix 1 μl 模 版 RNA,Entire genomic DNA 14μl( 被添加在步骤 5 ) elimination reaction 终反应体积