基因定位常用的方法.pptx

1 明确几个基本概念 基 因：DNA的功能片段。 基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因 外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的总和。 基因定位：是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。 第1页/共34页 2 遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。 染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。 第2页/共34页 3 一、基因定位的方法 1、体细胞杂交法基因定位： 体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。 1）体细胞杂交的概念： 也称细胞融合（cell infusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell），含双亲不同的染色体。 第3页/共34页 4 2）对象： 人的细胞 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠 3）杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色体，而啮齿类的染色体被保留下来。 第4页/共34页 5 4）原理： 细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。 第5页/共34页 6 HAT选择系统： 人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料 第6页/共34页 7 因此在HAT培养基上 人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受阻 。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍） 第7页/共34页 8 鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌呤和嘧啶都可以正常合成） 第8页/共34页 9 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上，这是首例应用体细胞杂交法进行的基因定位。 第9页/共34页 10 鼠 人 X TK- HPRT+ TK+ HPRT- 鼠 人 鼠 人 鼠 人 TK+ HPRT+ 17 3 17 3 17 3 TK+ TK+ TK- HAT 第10页/共34页 11 ②克隆嵌板法(clone panel method) 根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因定位方法。 克隆嵌板 杂种克隆 保留的人染色体 1 2 3 4 5 6 7 8 A + + + + - - - - B + + - - + + - - C + - + - + - + - 第11页/共34页 12 2.原位杂交和荧光原位杂交 1）原位杂交（in situ hybridization）：是最直接的