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植物超氧阴离子自由基含量的测定 一、实验目的 学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法 二、实验原理 进入生物体内的一些分子氧(O2)，可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。超氧阴离子自由基(O?)能与羟胺反应，生2? ?成NO?2，NO2能与对氨基苯磺酸和а-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著光吸收。因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基(O?)的含量。 2? 三、器材与试剂 1(实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶(10mL)、分光光度计 2(实验试剂 65mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8);提取缓冲液;10mmol/L盐酸羟胺溶液;58mmol/L对氨基苯磺酸溶液;7mmol/Lа-萘胺溶液;50μmol/LKNO2 标准溶液 3(实验材料 小白菜、小麦 四、实验步骤 1.制作标准曲线 取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。置25?保温箱20min。分别加入1mL 58mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1mL 7mmol/Lа-萘胺溶液，混匀。25?保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，NO?2物质的量(5μmol)为横坐标，制作标 准曲线。 表1 标准曲线试剂表 2.提取 取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4?离心10min，收集上清液，此液为植物O?2提取液。 3.测定 取2.0ml上清液，加入0.5ml 50mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.8)和0.1ml 10mmol/L盐酸羟胺溶液，摇匀，25?保温20min。取出加入1ml 58mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1ml 7mmol/L а-萘胺溶液，混匀，30?保温30min，加入等体积三氯甲烷萃取色素，10000r/min离心3min，取上层粉红色水相，测定530nm吸光度。 表2 NO?2产生 表3 NO?2产生显色(同标准曲线) 五、实验数据处理及分析 根据样品管显色液与对照管显色液吸光值的差值，从标准曲线上查出相应的NO?并换算成超氧阴离子(O?)物质的量的浓度，从而计算出O?2的浓度，2?2的含量。 O?Vt?n/(Fw?Vs) 2含量 μg/g =2x? 式中，n为羟胺氧化反应产生的NO?;Vt为酶提取液总体积(mL);2(μmol)Vs为羟胺氧化反应加入的粗酶提取液体积(mL);Fw为样品鲜重(g)。 由回归方程y=0.4906x+0.0151可得白菜中 NO?(5μg/ml)为0.654，2的浓度小麦中NO?2的浓度(5μg/ml)为0.193。 白菜中O?2的含量(μg/g)=2x?Vt?n/(Fw?Vs) =2×10×0.654/(1.178×2×5) =1.111 白菜中O?2的含量(μg/g)=2x?Vt?n/(Fw?Vs) =2×10×0.193/(1.016×2×5) =0.380780725 六、讨论 为什么O- 2主要分布在小白菜的维管束中, 通过观察可以发现，O- 2主要分布在小白菜的叶柄和叶脉,即维管束中。植物 在代谢过程中会产生许多活性氧自由基，线粒体是需氧生物细胞内产生O- 2最多的 地方。在整个电子传递链上传递大量电子时，已经有实验证实有些电子被漏出来，使氧气发生了电子还原而产生超氧阴离子自由基。 维管束是指维管植物的维管组织，由木质部和韧皮部成束状排列形成的结构。维管束彼此交织连接，构成初生植物体输导水分，无机盐及有机物质的一种输导系统。O- 2产生的途径有很多，适宜浓度的O-2在体内有重要意义，参与吞噬细胞杀 灭有害的微生物，协助清除衰老、褪变的细胞，消灭突变的细胞等。所以作为主要运输途径的维管束，O- 2在其中的含量必然会很高。 七、实验注意事项 1、分光光度计应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。要先预热10min，用0试管中的样品进行调零，比色杯的外壁要擦干净。 2、取待测样品研磨定容时，可对其质量及容积等体积放大，最好用纱布过滤，这样能保证上清液的澄清度。 3、离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭。使用时注意先配平。 4、介质尽量减少Fe