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DEAE纤维素梯层析会计学第1页/共13页一 实验原理 DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（DEAE）活性基团的弱碱性阴离子交换剂,它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、酶等大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这时可采用梯度洗提（装置见图1-2）。即用一定的样品离子在不同的离子强度（或pH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过不断改变洗提的离子强度pH不变）[根据实验的具体情况，也可同时改变离子强度和pH]，以逐步改变样品中各组分与离子交换剂的交换能力，最后得到分离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当A1=A2时，产生线形梯度；当A1A2时，产生凹型梯度；当A1A2时，产生凸型梯度。不同的样品，应根据实验情形，选择合适的梯度洗提曲线（见附1） 。 第2页/共13页 梯度洗脱示意图第3页/共13页二 实验目的与要求 通过DEAE-纤维素阴离子交换剂，采 用一条线型离子强度和恒定pH洗提曲线， 对鸡蛋白蛋白（CEA）粗制样品进行分级 分离，以了解梯度洗提的层析方法。第4页/共13页三 实验主要器材与装置 第5页/共13页3-1、实验仪器（1）、色谱工作站及装置（2）、笔记本电脑（3）、紫外检测仪（4）、梯度混合仪（5）、恒流泵3-2、实验器材第6页/共13页（1）、 层析柱（2）、 烧 杯（3）、 可调取液器（4）、 量 筒（5）、 玻 棒（6）、 标签纸（7）、 记号笔（8）、 洗耳球第7页/共13页 3-3、实验装置图 第8页/共13页四 试剂与配制 第9页/共13页4- 1 ．实验试剂（1）、三羧甲基氨基甲烷（Tris） （2）、鸡蛋白蛋白（CEA） （3）、DEAE-52（4）、盐 酸（5）、氯化钠第10页/共13页4-2．试剂配制（1）、Buffer A（20mM pH8.0 Tris-HCl ）的配制： 称取Tris 60.7mg ，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀 HCl调至pH8.0，最后加蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（2）、Buffer B的配制： 取Buffer A 50毫升，加氯化钠（1.0M）2.9克，溶解混匀即可。（3）、CEA样液的配制： 20.0mg CEA+1ml Buffer A五 方法与步骤第11页/共13页 1树脂的处理 2装 柱[ 柱 高 10.0cm ] 3平 衡[ 流 速 0.8 ml / mi n; 30.0 min ] 4上 样[ 上样体积 1.0ml ] 5洗 涤[ 1.0ml×2次;再自动洗涤15 min ] 6洗 脱[ 梯度混合仪 A – B杯,各倒入 A - B溶液60ml 最后一个峰已回到基线时，继续洗脱10分钟 ] 7收 集 8测 定第12页/共13页思考题1、DEAE-纤维素最佳吸附PH范围是多少？2、DEAE-纤维素再生最适酸、碱浓度是多少？