外周血的提取.ppt

外周血的提取 第一页，共十五页，2022年，8月28日 实验目的 掌握人全血DNA提取的原理和操作步骤。 了解DNA基本理化性质。 3. 初步了解DNA琼脂糖电泳鉴定的方法。 第二页，共十五页，2022年，8月28日 实验原理 1 保证DNA一级结构的完整性； 2 其他生物分子如蛋白质、多糖和脂类等分子的污染应尽量降低到最低； 3 尽量去除对后续分子实验有抑制作用的有机溶剂和重金属离子； 4 其他核酸分子RNA，应根据实际需要处理。 DNA提取总的原则 第三页，共十五页，2022年，8月28日 实验原理 理论上所有真核细胞、原核细胞、病毒等都可以提取DNA。 样本选择取决于实验目的。 全血是基因组提取中最常见的样本之一。 样本来源 第四页，共十五页，2022年，8月28日 理化性质 核酸是由碱基、戊糖及磷酸组成的生物大分子，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两类。 1. 酸碱性 核酸分子中有酸性的磷酸基和碱性的含氮碱基，属于两性化合物，但是磷酸基的酸性较强，所以核酸总体上表现为酸性，带负电荷。 2. 溶解度与粘度 核酸是极性化合物，微溶于水，其钠易盐溶于水，而不溶于乙醇、苯酚、氯仿、乙醚等有机溶剂。 核酸是高分子化合物，粘度很大。 3. 紫外吸收 核酸有强烈的紫外吸收，其最大吸收峰在260nm处，常以A260表示。 第五页，共十五页，2022年，8月28日 实验原理 生物的大部分或几乎全部的DNA都集中在细胞核或核质体中，人与动物的DNA主要存在于细胞核中，并与蛋白质结合的构成大小不一的染色体。所以蛋白质是DNA提取过程中常见的污染之一，而且蛋白质污染常常影响到以后的DNA操作过程，因此提取过程中要把蛋白质去除。 第六页，共十五页，2022年，8月28日 实验原理 本实验中DNA提取采用的是苯酚/氯仿抽提的方法。基本原理就是苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA却没有影响。经苯酚/氯仿抽提后，酚/氯仿相与水相完全分层，蛋白质变性而被离心沉降到酚/氯仿相和水相的界面，DNA则留在水相。标本中的脂类杂质溶解于酚/氯仿相，从而与水相分离得以去除。 第七页，共十五页，2022年，8月28日 实验原理 此方法提取得到的DNA可能会有RNA杂质，但是RNA极易降解。而且少量的RNA对DNA的后续操作没有大的影响，如有必要可以加入不含DNA酶的RNA酶去除RNA的污染。 第八页，共十五页，2022年，8月28日 实验步骤 1.首先取EDTA抗凝的人外周血2mL, 按照1:5～1:10的比例加入去离子水裂解8min，然后1700rpm/min离心，去掉含有红细胞碎片的上清液，重复裂解一次，留取白细胞沉淀。 第九页，共十五页，2022年，8月28日 实验步骤 DNA细胞裂解液(pH 8.0)： 150mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、 10 mmol/L EDTA、0.5%SDS DNA细胞裂解液中SDS的是表面活性剂，主要作用裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液里面。另外，Tris盐的作用是使抽提的出来的DNA容易进入水相，减少在蛋白质层的滞留。 2.加入0.5mL的DNA细胞裂解液来悬浮白细胞沉淀。 第十页，共十五页，2022年，8月28日 实验步骤 3. 悬浮后的溶液中添加蛋白酶K 20μL，65℃水浴0.5h，期间轻缓地倒转几次。 4. 室温下，添加0.5mL的苯酚/氯仿/异戊醇混合抽提液，剧烈地震荡混合10min，然后8000rpm/min离心10分钟，然后将水相移至新的离心管中。 细胞膜裂解以后，细胞中含有的蛋白质和DNA酶等释放到溶液中，而蛋白酶K 具有水解蛋白质和DNA酶的作用，并且在EDTA和SDS存在的条件下仍保持较高的活性。 在苯酚/氯仿加入少量的异戊醇，可以减少实验中气泡的产生，而且有利于分层，保持分层的稳定性。 第十一页，共十五页，2022年，8月28日