dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL的发现与功能研究.pptxVIP

dd结直肠癌肝转移负相关基因SPARCL的发现与功能研究会计学研究背景第1页/共15页大肠癌是常见的恶性肿瘤之一－－发病率 3～5位－－死亡率 4～5位大肠癌肝转移 －－ 治疗失败的主要原因之一肝脏－－远处转移的最主要转移部位预后较差，中位生存期为5～10个月大肠癌死亡病人（尸检） 可发现36％～81％的肝转移研究目的第2页/共15页寻找肿瘤转移相关标志物原发灶与转移灶特性相似转移决定于原发灶通过比较伴肝转移和无转移的肠癌原发灶来寻找转移相关基因Brabletz T, Nature Rev Cancer 2005材料与方法第3页/共15页基因表达谱数据，芯片类型：Affymetrix伴肝转移肠癌原发灶组织： 经病理证实有肝转移灶无转移肠癌组织： 手术后经随访三年以上无复发或转移组织类型病例数无转移肠癌组织13伴肝转移肠癌组织12第4页/共15页GSEA： Gene Set Enrichment Analysis，基因富集分析方法一种生物信息学方法，用来确定一组预先定义的基因在两组表型不同的样本间是否有表达差异。 预定义的基因：如属于同一Pathway的基因, 定位于同一Cytoband的基因本研究中用来发现基因表达存在差异表达的染色体区带Subramanian et. al, PNAS, 2005第5页/共15页无转移肠癌　　伴肝转移肠癌基因表达谱数据的GSEA分析表明：4q22为肠癌肝转移相关染色体显带，所包含的基因在无转移和伴肝转移肠癌间表达差异显著SPARCL1基因为4q22中最重要的基因（权重最高）SPARCL1基本情况第6页/共15页定位于人类染色体4q22，基因大小为35 kb，由11个外显子和 10个内含子组成mRNA长度是3 kb，编码664个氨基酸，蛋白质分子量约为 71 kDa，存在多个糖基化位点分泌型的基质细胞糖蛋白，参与多项机体生理过程，如细胞黏附，细胞增殖，肌肉分化以及 B 淋巴细胞成熟等在非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、慢性粒细胞白血病中表达下调，在肝癌中表达上调SPARCL1 mRNA的定量，SPARCL1蛋白的免疫组化无转移肠癌, 伴肝转移肠癌, 肝转移组织中表达情况SPARCL1 mRNA肝转移灶无转移肠癌伴肝转移肠癌SPARCL1基因低表达与肠癌肝转移有关第7页/共15页表达低： 伴肝转移肠癌 肝转移灶表达高： 无转移肠癌差异显著，P组织中SPARCL1 mRNA定量分析 空白HE SPARCL1无转移肠癌伴肝转移肠癌肝转移灶SPARCL1蛋白低表达与肠癌肝转移有关第8页/共15页表达低： 伴肝转移肠癌 肝转移灶表达高： 无转移肠癌差异显著，P=0.004 SPARCL1蛋白表达差异与mRNA一致SPARCL1蛋白的免疫组化分析第9页/共15页SPARCL1 表达载体构建及抗体制备构建带有 His 标签的原核表达载体pET-22b-SPARCL1构建用于真核表达的逆转录病毒载体pLXSN-SPARCL1合成多肽作为抗原，制备兔多克隆抗体及鼠单克隆抗体SPARCL1 蛋白重组表达和纯化pET-22b-SPARCL1 转化感受态大肠杆菌(BL21(DE3)/Polys)扩大培养并以 IPTG 诱导重组蛋白表达 Ni2+金属螯合层析柱纯化细胞周期实验细胞增殖实验细胞迁移实验SPARCL1功能研究第10页/共15页肠癌细胞系中高表达SPARCL1不影响：细胞周期和增殖能力影响： 迁移和侵袭能力SPARCL1蛋白表达与预后第11页/共15页生存分析175例结直肠癌病人P SPARCL1表达高者预后好SPARCL1表达与生存时间结合其他标志物判断预后第12页/共15页多标志物生存分析P53、MAPK、 E-cadherin、MSH2、ADCY-2、Shp2、SPARCL1遗传算法支持向量机P53+SPARCL1的模型可更好判断预后第13页/共15页SPARCL1基因的低表达与肠癌肝转移有关SPARCL1基因可能通过抑制细胞的迁移能力影响肿瘤转移SPARCL1表达高低可帮助判断肠癌病人的预后，结合经典肿瘤标志物如P53构建的多标志物模型可更好判断预后SPARCL1为分泌型蛋白，是潜在血清标志物肿瘤原发灶的分子事件是导致转移的主要因素第14页/共15页郑树葛维挺 芯片分析，mRNA定量分析虞舒静免疫组化，预后分析胡涵光抗体制备，真核表达，细胞实验，动物实验张航动物实验，相关通路分析陈华溶融合蛋白表达与纯化，ELISA谢谢